2018 Fiscal Year Annual Research Report
A new technology for creating plant virus resistance by protein-protein interaction of RNA replicase and genome editing of host factor gene
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16K07623
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
桑田 茂 明治大学, 農学部, 専任教授 (20328967)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大里 修一 明治大学, 農学部, 専任准教授 (30533228)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質-タンパク質間相互作用 / キュウリモザイクウイルス / ジャガイモYウイルス / アルファルフアモザイクウイルス / ゲノム編集 / RNA編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
RNA切断活性が報告されているLeptotricchia shahii由来CRISPR/C2c2のRNA切断活性を確認するためにC2c2遺伝子発現カセットとGFPmRNAをターゲットとするcrRNAカセットをもつベクターを構築して、GFP蛍光強度で判定する一過的発現系でGFPmRNAの切断活性を確認したところ、約80%程度にGFP発現を減少させることに成功した。そこで、CRISPR/C2c2遺伝子とcrRNAとしてアルファルファモザイクウイルス(AMV)のゲノムRNAの３’末端側のステム・ループ構造をターゲットとするcrRNAをもつコンストラクトでタバコを形質転換してC2c2発現体を3系統得た。形質転換体を自殖してホモ系統を得て、様々な濃度でAMV接種試験を行ったが、AMV病徴と外被タンパク質の蓄積が認められ、C2c2利用によるウイルス抵抗性を発揮するにはC2c2発現量の増強やターゲット配列の検討が必要と考えられた。また、ゲノム編集によるウイルス抵抗性付与の可能性を検証する目的で人工ヌクレアーゼCRISPR/Cas9を利用してPVYの感染・増殖に必要な宿主因子である真核翻訳開始因子eIF4E1遺伝子を破壊した形質転換タバコを作出した。形質転換当代をPCRと塩基配列決定により分析したところ、片アリルのみに変異（一塩基挿入）を持つ２系統が得られた。PVY抵抗性形質は劣性であることから、形質転換当代での抵抗性検定は行わず、自殖により次世代種子を取得してPCR産物の塩基配列決定により劣性ホモ個体を取得した。現在は劣性ホモ個体にPVYを接種して抵抗性検定を実施している。
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