2017 Fiscal Year Research-status Report
DNAプールから各種殺菌剤耐性変異の頻度を算出する遺伝子診断法の構築
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16K07629
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| Research Institution | Toyo University |
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Principal Investigator |
藤村 真 東洋大学, 生命科学部, 教授 (50297735)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 農業用殺菌剤耐性 / 遺伝子診断技術 / パイロシークエンス / サスペンジョンアレイ / 灰色かび病 / キュウリ褐斑病 / キュウリ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
複雑化する殺菌剤耐性菌の動向をモニターするために、パイロシークエンス法とサスペンジョンアレイ法を用いた遺伝子診断系の構築と、その有用性を検証することを目的としている。キュウリとトマトの主要病原菌の耐性変異を対象としており、昨年度までに構築したキュウリ病原菌に加えて、H29年度は、トマト病害である葉かび病菌およびすすかび病菌の耐性株を収集し、ベンズイミダゾール剤、QoI剤、SDHI剤、EBI剤の想定される耐性変異をパイロシークエンス法で検出する診断系を構築した。ただし、収集した葉かび病菌のSDHI耐性株のSchB遺伝子およびEBI耐性株のCyp51遺伝子に想定した耐性変異が認められず、現在、耐性遺伝子の探索を行っている。
サスペンジョンアレイ法については、昨年度のキュウリ褐斑病菌につづき、本年度は灰色かび病菌の耐性変異検出系を構築した。褐斑病菌のアッセイで使用した12種類のビーズを用いて、二段階法により5系統の薬剤（ベンズイミダゾール剤、QoI剤、SDHI剤、ジカルボキシイミド剤、ケト還元阻害剤）の計9種類の耐性変異を同時に検出する系を構築した。また、ASPE (Allele-Specific Primer Extension)法に加えてOLA(Oligo Ligation Assay) 法の変法であるMOL-PCR（Multiplex Oligonucleotide Ligation-PCR）法を検討し、それぞれの利点を明らかにした。
以上から、パイロシークエンス法とサスペンジョンアレイ法は検出原理とそれに伴う特長は異なるが、複雑化する殺菌剤耐性を圃場レベルで解析する新しいツールとなることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、新しい遺伝子診断法であるパイロシークエンス法とサスペンジョンアレイ法を用いて、代表的な野菜であるキュウリとトマトの各種耐性菌の検出系を構築し、その有用性を検証することを目的としている。パイロシークエンス法については、昨年度のキュウリの主要薬剤の各種耐性変異の検出系に加えて、本年度はトマトの葉かび病菌とすすかび病菌の各種耐性変異の検出系の構築がほぼ完成している。このことから、着実に研究は進展している。しかし、葉かび病菌の圃場分離株のSDHI耐性株などで、従来報告されている遺伝子部位に変異がみられない株が存在したことから、耐性遺伝子の特定と変異同定をおこなう必要があることが判明している。このことから、おおむね順調に進展しているとした。サスペンジョンアレイ法については、多種類の耐性菌が分布する灰色かび病菌で網羅的に耐性変異検出ができることが明らかになっており、順調に研究は推移している。
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| Strategy for Future Research Activity |
キュウリとトマトの主要病害で問題になっている殺菌剤耐性菌について、耐性変異を検出する系を順調に構築してきた。これまでの研究から、トマト葉かび病菌のSDHI剤とEBI剤の耐性変異が想定したいたものと異なることが判明したことを受けて、平成30年度は、これらの耐性遺伝子とその変異を同定する。また、最終年度として、これまで構築してきた遺伝子診断系を用いて、耐性菌モニタリングの圃場検証を念頭に研究を行う。特にパイロシークエンス法が混合DNAサンプルから耐性菌比率を算出できる可能性を検証する。圃場から分離した株の個別診断と集団診断の相関を調べる。当初計画では、トマト葉かび病を中心ととして、圃場検証を予定していたが、耐性変異が未同定のものが含まれていたため、キュウリ褐斑病およびうどんこ病を用いて、個別診断と集団診断の相関を調べる予定である。
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| Remarks |
東洋大学生命科学部環境応答研究室ホームページ
http://www2.toyo.ac.jp/~mfujimura/
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