2018 Fiscal Year Research-status Report

セスバニア根粒菌が巨大構造体R-bodyにより宿主細胞核を崩壊させる分子機構

Research Project

Project/Area Number	16K07638
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	青野俊裕東京大学, 生物生産工学研究センター, 講師 (10372418)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	齋藤勝晴信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (40444244)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2020-03-31
Keywords	根粒菌 / 病原性 / R-body / reb遺伝子群 / rebオペロン
Outline of Annual Research Achievements	マメ科植物セスバニアの根粒菌は巨大構造体R-bodyの生産に関与するrebオペロンを持つ。rebオペロンが恒常的に高発現する変異株が宿主細胞に感染すると、R-bodyにより宿主細胞は殺傷される。rebオペロン発現の直接的抑制因子として転写因子PraRを、間接的抑制因子として転写因子AZC_3265とLonプロテアーゼが判明している。rebオペロンの発現は、低温かつ2-オキソグルタル酸濃度が高い条件下で誘導される。本研究では、[課題1]rebオペロンの発現制御機構の全容解明、[課題2]R-bodyによる宿主殺傷機構の全容解明を目的とし、以下のように研究を進めた。 [課題1]高温時におけるrebオペロンの発現抑制には、ベータガラクトシダーゼ遺伝子の転写促進因子AmpRが関与していることがこれまでに明らかになっている。本年度は、AmpRがrebオペロンのプロモータ領域に直接作用するのかを判断するために、タグを付加させた組換えAmpRの精製をまず試みた。しかし、汎用されるタグ（His6,FLAG,GST,MBP等）を付加させたAmpRを大腸菌で発現させ精製を試みると、ほぼ全て不溶性画分に存在することが判明した。これは低温誘導発現プラスミドプラスミドやシャペロンを用いても改善されなかった。また、尿素変性による可溶化は可能だが、リフォールディングは全く成功しなかった。一方、rebオペロンの新たな制御因子の探索を、rebオペロン-lacZ融合株群を基にしたトランスポゾン変異株群のスクリーニングにより試みた。その結果、新たに、機能未知の転写因子、二成分制御系、膜タンパク質がrebオペロンの発現に関与することが判明した。 [課題2]rebオペロン高発現株を基にした変異株群からの正常共生株のスクリーニングは本年度も進行中である。しかし、依然として、重要と判断される遺伝子の同定には至っていない。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究で重要と考えられる転写因子AmpRの精製が全く成功しないため、その先の実験が進展しなかった。また、rebオペロンの発現に関与する新規制御因子群が発見されたが、透過型電子顕微鏡の不具合により、それらが実際にR-body生産に関与することが観察できなかった。
Strategy for Future Research Activity	転写因子AmpRの精製に関しては、大腸菌における組換えタンパク質の発現ではなく、セスバニア根粒菌そのもので組換えタンパク質を発現させ、精製することを試みる。同時に、無細胞翻訳系も試みる。また、透過型電子顕微鏡は修復されたため、新たな制御因子群の機能解析を再開する。
Causes of Carryover	（理由）実施予定であった二課題について、技術的なトラブルが多く発生し、研究が十分に進捗しなかった。（使用計画）今年度の計画をそのまま次年度に移行し、特にタンパク質精製に関するあらゆる改善策を試みることに予算を使用する。