2017 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K07644
|
|---|
| Research Institution | Hiroshima University |
|---|
Principal Investigator |
冨永 るみ 広島大学, 生物圏科学研究科, 准教授 (20373334)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | シロイヌナズナ / 根毛 / 転写因子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
植物の根毛は、根圏土壌との相互作用において重要な役割を果たす。本研究では、根毛形成を制御するMYB転写因子CAPRICE (CPC)ファミリーの機能を解析し、根毛機能強化を目指した基礎研究を展開している。我々はこれまでにCPCの重要な機能として、細胞間移行すること等を明らかにしてきた。さらにCPCファミリーには、タンパク質分解が早いものとそうでないものがあることを見出した。そこで本研究では、タンパク質分解に重要なアミノ酸モチーフの特定を試みた。また、リン酸欠乏応答による根毛増加へのCPCファミリー遺伝子の関与を検証し、根毛発生制御モデルの構築を検討している。
アミノ酸配列の比較により、シロイヌナズナのCPCファミリーのうちタンパク質分解が早いTRIPTYCHON (TRY)とENHANCER OF TRY AND CPC2 (ETC2)は、他の3つのホモログ（CPC, ETC1, CPC LIKE MYB3）に比べて約20アミノ酸ほど長いC末端配列を持つことがわかった。この長いC末端配列に着目し、タンパク質分解に関与しているかどうかを検証するために、TRY及びETC2のC末端配列を取り除いたDNAコンストラクトを作製し、シロイヌナズナに形質転換した。その結果、C末端を取り除いたCPC::TRYΔC:GFPおよびCPC::ETC2ΔC:GFPコンストラクトをシロイヌナズナに導入すると、形質転換体は、それぞれ顕著に根毛数が増加することがわかった。この結果から、C末端配列を取り除いたTRY及びETC2は、根毛形成を促進する機能を獲得することがわかった。また、GFP融合タンパク質の局在を観察したところ、C末端配列の除去により、TRYΔC:GFPおよびETC2ΔC:GFPによる強いGFP蛍光の回復が見られた。以上のことから、TRY及びETC2のC末端配列が、タンパク質分解に関与していることが明らかになった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
CPCホモログのタンパク質分解は、ユビキチン化を経由したプロテアソーム分解によるものなのか、エンドサイトーシスやリソゾームでの分解によるものかを明らかにするために、様々な阻害剤を用いた実験を行った。ERからゴルジ体への輸送阻害剤であるBFAやプロテアーゼ阻害剤であるE-64dによる阻害効果は見られず、ユビキチン・プロテアソーム系による分解の可能性が高いことが示唆された。しかし、GFP融合タンパク質を持つ形質転換体の蛍光局在観察では、今のところプロテアソーム阻害剤（MG132, MG115等）処理によるはっきりした実験結果は得られなかった。そこで、長時間プロテアソーム阻害剤処理した上記の植物体からタンパク質を抽出し、抗GFP抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分解抑制の効果を確認した。その結果、CPCファミリータンパク質には、ユビキチン・プロテアソーム系による分解を受けているものがあることが明らかになった。また、この分解には、TRYおよびETC2タンパク質の約20アミノ酸からなるC末端配列が重要であることも明らかにした。以上の結果をまとめ、Development誌に発表することができたので、本研究は、当初の計画以上に進展したと言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
シロイヌナズナのCPCファミリータンパク質の分解機構については、引き続き解析を進める。また、分解機構に関与する、TRY及びETC2タンパク質のC末端アミノ酸のリン酸化の機構についても解析したいと考えている。TRY及びETC2タンパク質のC末端配列から、リン酸化される可能性の高い候補アミノ酸（セリンまたはスレオニン）を特定し、そのアミノ酸をアラニン置換する。アミノ酸置換したTRYまたはETC2のタンパク質分解が抑えられるかどうかを観察することで、重要なアミノ酸を特定する。
リン欠乏培地で育て、根毛数が増加したシロイヌナズナにおける、CPCファミリー（CPC, TRY, ETC1, ETC2, CPL3）および根毛形成制御関連遺伝子群（WER, GL3, EGL3, GL2等）の発現を、Real-Time PCRにより解析する。また、リン欠乏条件でのCPCファミリーpromoter::GUS発現（CPC::GUS, TRY::GUS, ETC1::GUS, ETC2::GUS, CPL3::GUS形質転換体は既に作出）を詳細に観察し、組織特異的な影響についても解析する。
cpc突然変異体あるいは過剰発現体（35S::CPC）のリン欠乏応答について、根毛形成関連遺伝子の発現、および根毛数の増減を中心とした表現型の変化を指標に解析し、CPCによる根毛形成機構がリン酸シグナルの下流に位置するものかどうかさらに確認する。
|
| Causes of Carryover |
理由：研究を進める上で、消耗品や試薬を大量に購入しており、調達の過程で節約に努めたため。
使用計画：今後さらに分子生物学的解析のための消耗品が必要だと予想される。また、いくつかの論文投稿を準備中のため、これらが受理された際にはさらに投稿料等が必要になる。これらの費用としての次年度使用額の使用を計画している。
|
