2016 Fiscal Year Research-status Report
普遍的な鉄硫黄クラスター生合成と根粒菌独自に進化した共生窒素固定との接点を解く
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16K07654
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
三井 久幸 東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (40261466)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 共生窒素固定 / 鉄硫黄タンパク質 / 根粒菌 / 進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
根粒菌は、マメ科植物との間で進化した共生窒素固定能が特徴的なグラム陰性細菌である。一方、真核生物と原核生物両方に分布する機能未知のDUF59ファミリータンパク質は、地球上の生物に普遍的に存在する鉄硫黄タンパク質の生合成に関与する可能性がある。根粒菌Sinorhizobium melilotiのDUF59タンパク質SufTが鉄硫黄タンパク質生合成と共生窒素固定の成立の両方にいかに組み込まれているかを探るために、そのsufT変異株を分離した。野生型と比べて、生育速度の低下、鉄飢餓に対する感受性増大、数種類の鉄硫黄酵素の活性低下、および共生窒素固定不全といった表現型を確認したことによって、SufTがSUFシステムを介した鉄硫黄タンパク質合成を促進し、そのことが共生窒素固定に重要であることが分かった。次に、S. melilotiのsufT変異株の生育速度が改善した自発的サプレッサー変異株を分離し、そのゲノム解析を行った。その結果、包括的鉄制御因子をコードするrirA遺伝子に欠失が見つかり、その後、その機能欠損がsufT変異に伴う全ての表現型（生育速度、鉄硫黄酵素の活性、共生窒素固定能）をサプレスすることを証明した。この結果は、rirA変異に伴う細胞内の鉄レベルの増加によって、鉄硫黄タンパク質生合成過程におけるSufT機能の欠損の影響を補われることを示唆している。
SufTの機能が細胞内の個々の鉄硫黄タンパク質の生合成に及ぼす影響を解析するために、鉄硫黄タンパク質としてRirA、ホスホグルコン酸脱水素酵素、アコニターゼを選び、それぞれのエピトープタグ付加タンパク質をコードする遺伝子をS. melilotiゲノムに組み込んだ。次年度に実施するそれらのタンパク質の鉄硫黄クラスター含有レベルの測定に役立てる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
根粒菌のSufTの共生窒素固定における必須の役割、および鉄硫黄タンパク質生合成の効率に関する役割を明らかにすることに成功した。更に、その機能解明を深めるための実験準備も、おおむね順調に進めることができた。ただし、根粒菌の共生成立過程の時期特異的発現を誘導するプロモーターを用いた「sufT変異の影響を共生成立過程で一過的に顕在化させる」試みが、根粒菌ゲノム上の遺伝子でのプロモーター置換操作が難渋した結果、予定以上の時間を費やし、そのあおりで、計画していた酵母two-hybrid解析を次年度に回さざるを得なくなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞内の鉄硫黄クラスター生合成過程におけるSufTタンパク質の機能や既知の因子とSufTとの相互作用を解明すること、およびSufTはどのような共生窒素固定に重要な鉄硫黄タンパク質の生合成に関与しているのか明らかにすることが目標である。今後、細胞内鉄硫黄クラスターのトレーサー解析、タンパク質相互作用の酵母two-hybrid解析、鉄硫黄タンパク質の細胞内レベルの網羅的解析等に重点を置いて今後の研究を進める。
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| Causes of Carryover |
当初、平成28年度計画にあった酵母two-hybrid解析を平成29年度の実施に変更したため、それに必要な試薬・キット購入費に相当する金額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当初、平成29年度に計画していた、エピトープタグ付加鉄硫黄タンパク質の免疫的検出の条件検討が平成28年度に大きく進んだので、平成29年度は、当初の計画をよりスピーディーに進めるとともに、加えて、平成28年度に実施できなかった酵母two-hybrid解析を実施すべく、助成金を使用する計画である。
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