2016 Fiscal Year Research-status Report

大腸菌におけるマロニル-CoA生合成経路の強化と脂肪酸生産菌の分子育種

Research Project

Project/Area Number	16K07655
Research Institution	Ibaraki University
Principal Investigator	長南茂茨城大学, 農学部, 教授 (70312775)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	マロニル-CoA / 脂肪酸 / 脂肪酸合成酵素 / パントテン酸キナーゼ / アセチル-CoAカルボキシラーゼ / コエンザイムA / 有用物質生産 / 大腸菌
Outline of Annual Research Achievements	本研究の最終目標は、コエンザイムA（CoA）生合成経路の鍵酵素であるパントテン酸キナーゼ（CoaA）を用いてアシル基のキャリアであるCoAを増加させ、有用物質生産に結びつけることである。本申請ではCoaAによって細胞内CoAレベルが上がった大腸菌のCoA増産株を用いて、アセチル-CoAをアセチル-CoAカルボキシラーゼ（Acc）でマロニル-CoAに変換し、さらに増加したマロニル-CoAを脂肪酸合成酵素（FAS）で脂肪酸を生産することで、物質生産におけるCoAコファクターエンジニアリングの有用性を示すことを計画した。最初に大腸菌由来Accの発現プラスミドを構築し、CoA増産株における細胞内マロニル-CoAの生産を検討した。大腸菌由来AccはAccA、AccB、AccC、およびAccDの4つのサブユニットから構成されており、4つすべて遺伝子を持つAccABCD発現プラスミド、および二酸化炭素をアセチル-CoAに付加する活性を持つAccAD発現プラスミドを保持する形質転換体では生育が全く観察されず、またAccD発現プラスミド保持菌でも明らかに生育が悪かった。しかしながら、AccABC、あるいはAccBCDの発現プラスミド保持菌ではマロニル-CoAへの変換が見られた。Corynebacteriumu glutamicum由来FASの発現プラスミドの構築も終了しており、現在、脂肪酸生産の条件検討をしている。脂肪酸生産量の増加傾向は見られるが培養条件、宿主の選択など検討の余地が残されている状況である。特筆すべきは、CoaAを大腸菌のゲノムDNAに導入した菌株おいて、これまで解析に使用してきたプラスミドでCoaAを発現させた株よりIPTG添加で3.6倍、非存在下でも同等のCoAレベルを示すことが明らかとなったことである。この株は抗生物質の培地への添加が不要であり、かつ生育も良いので、今後は本菌株を宿主として解析を進める予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成28年度はアセチル-CoAからマロニル-CoAへの変換に時間を費やしたが、大腸菌由来Accではサブユニットを組み合わせて発現させることで顕著ではないが、細胞内マロニル-CoAレベルをおよそ25%上げることに成功した。マロニル-CoAは専ら脂肪酸合成に使用される代謝中間体であるため、これ以上細胞内濃度を上げることは困難かもしれない。しかしながら、この発現系にFASの発現系を組合わせれば、効率よく脂肪酸生産に流れることが期待される。FASによる脂肪酸生産実験は、大腸菌からの中性脂肪および脂肪酸の抽出法、ガスクロマトグラフィー（FID検出器）による分析法が確立した。C. glutamicum由来FASが細胞内で機能しているかどうかが鍵となるが、今後は宿主をゲノムDNAにCoaAを導入したCoA増産株（JB9-coaA株）を使用し、解析を進める予定である。平成28年度は前述のJB9-coaA株の構築に成功し、CoA増産において過去の実績より良いデータだ得られたことが最も進歩したところである。このことにより、複数のプラスミドを同時に保持させる必要がなくなり、プラスミドの保持安定性などの不確定要素を排除することができる。 JB9-coaA株の構築は連携研究者の茨城大学農学部・西澤智康准教授と共に行った。
Strategy for Future Research Activity	平成29年度は、宿主をJB9-coaA株にして、マロニル-CoAの増産および脂肪酸生産試験を行う予定である。マロニル-CoA増産に関してはAccをC.glutamicum由来の遺伝子に変更し、同一プラスミドでFASと共に発現させ、生育阻害を軽減する生産系で解析を進める。C.glutamicum由来Accは2つのサブユニットから構成されているため、大腸菌由来の4つのサブユニットより発現制御がより簡単に行えることが期待される。また、CoA増産には出発物質のパントテン酸の培地への添加が不可欠であるが、パントテン酸供給系にはアスパラギン酸デカルボキシラーゼ（PanD）およびケトパント酸ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（PanB）が効果的であることは既に明らかにしており、また、これら酵素に加えてケトパント酸レダクターゼ（PanE）の有効性も報告されている。そこで、もう一つのパントテン酸シンテターゼ（PanC）も含めて、panBCDEをJB9-coaA株のゲノムDNAに導入し、パントテン酸を培地に添加することなく、CoAを増産できるJB9-coaA-panDBEC株を構築予定である。 JB9-coaA-panDBEC株の構築は連携研究者の茨城大学農学部・西澤智康准教授と共に実施する予定である。
Causes of Carryover	当初予定より若干安価に済ませることができたため、千円単位の端数が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	平成29年度実施分の支払請求額とともに、当初計画どおりに使用する。