2017 Fiscal Year Research-status Report
大腸菌におけるマロニル-CoA生合成経路の強化と脂肪酸生産菌の分子育種
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16K07655
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
長南 茂 茨城大学, 農学部, 教授 (70312775)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | マロニル-CoA / 脂肪酸 / 脂肪酸合成酵素 / パントテン酸キナーゼ / アセチル-CoAカルボキシラーゼ / コエンザイムA / 有用物質生産 / 大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の最終目標は、コエンザイムA（CoA）生合成経路の鍵酵素であるパントテン酸キナーゼ（CoaA）を用いてアシル基のキャリアであるCoAの細胞内濃度を上げることによって炭素代謝を活性化させ、有用物質生産に応用することである。本申請では、CoaAによる大腸菌（Escherichia coli）のCoA増産株を用いて、アセチル-CoAカルボキシラーゼ（Acc）と脂肪酸合成酵素（FAS）を組み合わせて脂肪酸を増産させ、物質生産における補酵素CoAのコファクターエンジニアリングの有効性を示すことを目標にしている。平成28年度はDH5α株とE.coli由来のAccの組合せでマロニル-CoA増産を目指したが、平成29年度は宿主をJM109株、AccをCorynebacterium glutamicum由来に変更して解析を進めた結果、脂肪酸の増産が確認された。さらに、FASを組み合わせると、脂肪酸生産量はおよそ1.5倍に上昇し、ここにCoaA遺伝子を追加すると、単位培養液当たりの生産量はわずかに減少するが、菌体重量当たりの生産量は17%上昇した。実験回数が少ないため、現時点では明言できないが、物質生産におけるCoAコファクターエンジニアリングの有効性に希望が見えてきた状況にある。前記した増産を達成するには、CoAの出発物質であるパントテン酸を培地に添加する必要があるが、この問題を解決するために、パントテン酸生合成経路に関与する酵素遺伝子（Pan遺伝子）を放線菌の部位特異的組換え機構を利用して、E.coliのゲノムDNAに導入する研究も並行して実施している。平成28年度までに、CoaAを導入したCoA増産株（JB9-coaA株）の構築に成功している。平成29年度はJB9-coaA株に4種のPan遺伝子を導入するためのプラスミド構築を行い、現在、導入を試みている状況である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成29年度は、宿主をJM109株、AccをC.glutamicum由来の酵素に変更し、脂肪酸増産を解析した。これらの変更によって、脂肪酸の顕著な増産が確認され、さらにC.glutamicum由来のFASによっても脂肪酸生産が促進されることが明らかとなった。これらの条件下で、CoaAによる細胞内CoAレベルの上昇が脂肪酸生産に及ぼす影響を検討した結果、形質転換体の増殖がわずかではあるが悪くなるため、単位培養液当たりの生産量もわずかに低くなるが、菌体当たりの生産量は明らかに上昇した。試験回数が少ないため、現時点では明言できないが、CoA増産の物質生産への有効性が示されつつある状況になってきている。
平成28年度に、放線菌の部位特異的組換え機構を利用して、プラスミド上のCoaAではなく、ゲノムDNA上に導入されたCoaAによってCoA増産を達成するJB9-coaA株の育種に成功している。平成29年度はパントテン酸の添加無しに自立してCoAを増産する菌株の育種に着手した。具体的には、パントテン酸生合成遺伝子であるpanB、panC、panD、およびpanEを保持する部位特異的組換え用プラスミドの構築を完了し、JB9-coaA株のゲノムDNAへの導入する準備が整った状況にある。ゲノム型CoA増産菌の育種は連携研究者の茨城大学農学部・西澤智康 准教授と共に行った。
前者のCoaAの脂肪酸生産への有効性を示す研究は、宿主およびAccの変更により、進度はやや遅れている状況ではあるが、変更により質の良い結果が出てきている。また、後者のゲノム型CoA増産株の育種の研究も、当初予定していたpanBおよびpanDに加え、panCとpanEもクローニングしたため、進度としては予定より遅れている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度の研究で対象とする遺伝子および宿主は確定したので、平成30年度は作出した形質転換体を解析し、総括する。具体的には、CoaA遺伝子、Acc遺伝子、FAS遺伝子を組み合わせた形質転換体を培養し、脂肪酸生産量および組成をガスクロマトグラフィーで、細胞内CoAプールのサイズおよび組成を当研究室で開発された酵素的微量定量法・アシル-CoAサイクリング法で、培養液中の残糖および酢酸などの代謝産物を液体クロマトグラフィーでそれぞれ解析する。また、形質転換体の生育に伴う物質生産の経時変化も追跡して、CoA増産の物質生産における有効性評価の精度を上げる予定である。ゲノム型CoA増産菌の方は導入菌株が取得され次第、CoA増産を解析し、脂肪酸生産を試みる予定である。ゲノム型CoA増産菌の育種は、引き続き研究協力者の茨城大学農学部・西澤智康 准教授と共に実施する予定である。
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| Causes of Carryover |
（理由）当初予定より全体的に進度がやや遅れていることが原因で、およそ3万円の残予算が生じた。
（使用計画）平成30年度実施分の支払請求額とともに、当初計画通りに使用する。
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Research Products
(1 results)
