2016 Fiscal Year Research-status Report

好熱性真菌における高安定性，高活性，広基質特異性D-アミノ酸酸化酵素の探索と解析

Research Project

Project/Area Number	16K07660
Research Institution	Nagaoka University of Technology
Principal Investigator	高橋祥司長岡技術科学大学, 工学研究科, 准教授 (90324011)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	好熱性真菌 / D-アミノ酸資化 / Rasamsonia emersonii / Thermomyces dupontii / D-アミノ酸オキシダーゼ / DAOホモログ遺伝子 / 大腸菌発現ベクター
Outline of Annual Research Achievements	D-アミノ酸化酵素（DAO）は，セファロスポリン系抗生物質合成の中間体である7-アミノセファロスポラン酸の生産，D-アミノ酸の検出・定量，アミノ酸ラセミ体の光学分割や医薬品や医薬品原料となるケト酸や非天然L-アミノ酸の生産など，工業的に有用な酵素である．そこで本研究は，高い安定性を有し，高活性で多様な基質に作用するDAOを世界に先駆けて見いだし，その応用的利用へ展開するための基盤を築くことを目的とした．研究計画では，（１）広基質特異性DAOを有する好熱性真菌の単離とDAOホモログ遺伝子の単離，（２）DAOホモログ遺伝子の大腸菌発現系の構築，選抜と発現産物の酵素学的諸特性解析の達成を目指している．今年度は，主に研究計画①について検討した．市販堆肥の懸濁液を，抗生物質を含むPDA培地に塗布し50℃で培養を行ったところ，3株の糸状菌が生育した．これら糸状菌を，既知DAOが貧基質とするいくつかのD-アミノ酸を唯一の窒素源とした培地で培養したところ，いずれの菌株も生育したが，YA1株と名付けた株が良好に生育した．これら糸状菌はそのITS領域の塩基配列から，YA1株はRasamsonia emersoniiと他の株はThermomyces dupontiiであった．これら糸状菌の他菌株のゲノム配列にDAOホモログ遺伝子の存在が確認されたため，その配列を基に単離株のDAOホモログ遺伝子の取得をPCRにより試みたところ,YA1株において取得でき，その推定アミノ酸配列からDAO遺伝子であると考えられた．そこで，その推定アミノ酸配列を基に遺伝子を合成し，大腸菌発現ベクターを作成した．また，好熱性真菌ゲノムデータベースの探索により，他の種々の好熱性真菌にもDAOホモログ遺伝子の存在を見いだすことができたことから，同様にこれら遺伝子の推定アミノ酸配列をもとに遺伝子を合成し，大腸菌発現ベクターを作成した．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究は，高い安定性を有し，高活性で多様な基質に作用する工業的に有用なDAOを世界に先駆けて見いだすことを目指している．今年度は主として，（１）D-アミノ酸資化能を有する好熱性真菌の単離と単離した好熱性真菌からのDAOホモログ遺伝子の単離，（２）ゲノムデータベース検索による種々の好熱性真菌からのDAOホモログ遺伝子の単離を目指した．検討の結果，（１）の検討に関しては，堆肥よりD-アミノ酸資化能を有する好熱性糸状菌を3株単離することができ，これらの株がRasamsonia emersoniiおよびThermomyces dupontiiに属することを明らかにした．また，D-アミノ酸で良好に育つR. emersoniiからDAOホモログ遺伝子を単離することができた．（２）の検討に関しては，ゲノムデータベースより種々の好熱性真菌（Chaetomium thermophilum, Calcarisporiella thermophila， Myriococcum thermophilum, Scytalidium thermophilum, Thermoascus crustaceous）にDAOホモログ遺伝子を見いだすことができた．さらに，大腸菌発現に適したコドンからなるこれらDAOホモログ遺伝子のDNAを合成し，大腸菌発現ベクターを作成した．以上の理由から，現在までの進捗状況は概ね順調に進展していると考えられる．
Strategy for Future Research Activity	今後の研究推進方策については、概ね計画書通り以下の項目について検討する予定である．（１）作成した種々の好熱性真菌DAOホモログ遺伝子の大腸菌発現ベクターを大腸菌に導入し，好熱性真菌DAOの大腸菌における発現を検討する．DAOの発現が確認できた大腸菌粗抽出液を用いて，基質特異性や熱安定性を解析し，高安定性，高活性かつ広基質特異性DAOを選抜する．なお，封入体などを形成し活性体として発現しないDAOについては，発現ベクターの変更などにより活性体としての発現を目指す．（２）（１）で選抜されたDAOを大腸菌粗抽出液から金属キレートアフィニティーカラムを用いて精製し，温度安定性，至適温度，pH安定性，至適pH，基質特異性や反応のカイネティクスなどの酵素学的諸特性を解析し，目的のDAOであるか否か明らかにする．
Causes of Carryover	微生物培養用簡易ファーメンターシステムを2基購入予定であったが，1基の予算が予定より高くなったことおよび消耗品費に計画以上の支出が生じたため2基購入できなくなったことが次年度使用額が生じた理由である．
Expenditure Plan for Carryover Budget	現在，本研究は順調に進展しているので，交付申請書に記載した「研究の目的」の達成に向けて，交付申請書に記載した「平成29年度以降の研究計画・方法」および「今後の研究の推進方策」にしたがって，主に酵素の精製や特徴解析に必要とされる試薬や器具などの消耗品を購入する計画である．また，本研究で得られた研究成果を積極的に発表するための論文投稿に関わる費用や旅費にも支出する計画である．