2018 Fiscal Year Annual Research Report
Isolation and characterization of highly stable, highly catalytic and broad substrate specificity D-amino acid oxidase of thermophilic fungi
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16K07660
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
高橋 祥司 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (90324011)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸オキシダーゼ / Rasamsonia emersonii / 耐熱性 / 好熱性真菌 / クローニング / 酵素学的緒特性 / 構造機能相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
D-アミノ酸化酵素（DAO）は，抗生物質中間体7-アミノセファロスポラン酸の生産，D-アミノ酸の検出・定量，アミノ酸ラセミ体の光学分割や医薬品原料となるケト酸や非天然L-アミノ酸の生産など，工業的に有用である．そこで本研究は，高い安定性を有し，高活性で多様な基質に作用するDAOを世界に先駆けて見いだし，その応用的利用へ展開するための基盤を築くことを目的とした．
目的を達成するため，申請者らはD-アミノ酸資化能を有する好熱性真菌Rasamsonia emersonii YA株を堆肥より単離し，そのDAOホモログ遺伝子（ReDAO）を見いだした．大腸菌で発現させたReDAOは，本来DAOが基質としない酸性D-アミノ酸を含む多様なD-アミノ酸やセファロスポリンCにも作用した．また，既知の真菌由来のDAOよりも高い熱安定性を有していた．このことから，ReDAOは目的の高熱安定性かつ広基質特異性DAOであることが分かった．ReDAOと好熱性真菌Thermomyces dupontii NRRL 2155株由来の狭基質特異性DAO（TdDAO）のアミノ酸配列比較から，ReDAOにおける部分的なアミノ酸配列の欠失が観察され，TdDAO挿入配列の欠失及びReDAOへの挿入はそれぞれ広基質特異性及び狭基質特異性へと変化させたことから，この欠失が広基質特異性の要因と考えられた．さらに，ReDAOの熱安定性低下変異体の解析から，タンパク質表面に位置するアミノ酸残基の変異により耐熱性が大きく低下することが示されたことから，サブユニット間相互作用が耐熱性に大きな役割を担っている可能性が示唆された．さらに，ReDAOの結晶を作成し，約2.0Åの解像度のX線解析画像を取得することに成功した．今後，ReDAOの三次元構造を明らかにし，より詳細にその広基質特異性及び高熱安定性メカニズムを解析する予定である．
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