2017 Fiscal Year Research-status Report
原核細胞の細胞骨格による磁気感知オルガネラ配置の分子機構
| Project/Area Number |
16K07661
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa University |
|---|
Principal Investigator |
田岡 東 金沢大学, 自然システム学系, 准教授 (20401888)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 細胞骨格 / 細菌 / オルガネラ / 磁気感知 / アクチン / 生細胞イメージング / 高速原子間力顕微鏡 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、磁性細菌の細胞骨格MamKがどのようにして、磁気オルガネラ「マグネトソーム」を直鎖状に細胞内配置するのか、そのメカニズムの解明を目指す。
１、生細胞イメージングによるMamK細胞骨格の機能解析 全反射蛍光顕微鏡を用いたMagnetospirillum magneticum AMB-1細胞内のマグネトソームの細胞内動態を観察した。mamK欠損株では，マグネトソームは細胞内をランダムに移動して分散するか，大きな蛍光輝点に凝集し，細胞内の偏った位置に存在していた。そこで，mamK欠損株でのマグネトソームの拡散定数を調べたところ、マグネトソームが単純拡散によって分散していることがわかった。本研究からMamK細胞骨格は、マグネトソームを直鎖状構造に固定することで，マグネトソームの単純拡散による分散や、磁気相互作用による凝集を防ぎ、棒磁石のような構造を細胞中央に維持することで、マグネトソームの磁気センサーとしての機能を支えていることが明らかになった。ATPase活性を持たない変異型MamK蛋白質をmamK欠損株で発現させ、マグネトソーム動態を調べた。変異型MamK蛋白質を発現させた細胞では、MamK細胞骨格とマグネトソームの結合効率の低下し、マグネトソームの直鎖状配置には、MamKのATPase活性を介した細胞骨格繊維の動態が関わっていることが示唆された。これらの成果を論文に報告した（mBio (2017)）。
2、全反射蛍光顕微鏡を用いたMamK in vitro重合解析 蛍光標識した単量体MamKとBiotin標識した単量体MamKを用いて、カバーガラス上でATP依存的に重合するMamK繊維を全反射蛍光顕微鏡で観察することに成功した。全反射蛍光顕微鏡と高速原子間力顕微鏡を観察手法として、in vitroでMamKの重合反応や再構成実験を行うための実験系を確立した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では、生化学、分子生物学的手法に加えて、高速原子間力顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡による生細胞蛍光イメージングを、それぞれin vitro とin vivo からのアプローチとして用い、MamK 細胞骨格がどのようにマグネトソームを形成し、磁気センサーとしての役割を支えているか、を明らかにする。
平成29年度までに、生細胞蛍光イメージングを用いた観察により、MamKの生理的機能を明らかにしたほか、変異型MamK蛋白質を用いてマグネトソームの動態解析を行なった。研究成果を論文発表し、in vivoからのアプローチとしては当初計画の目標を達成した。一方、全反射蛍光顕微鏡を用いた、in vitroでのMamK細胞骨格の観察系を確立し、MamK細胞骨格の機能メカニズムの解明を目指した再構成実験への実験基盤が確立した。以上のように、研究計画に従い順調に進展しており（２）を選択した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は、MamK重合特性解析、およびMamK細胞骨格―MamJ―マグネトソームの再構成系の構築を試みる。これにより、MamK細胞骨格によるマグネトソーム配置のメカニズム解明を目指す。そのため、MamK細胞骨格に結合する蛋白質であるMamJ蛋白質を精製し、精製したMamJと単量体MamKを用いて、MamK-MamJ分子間相互作用や、MamJがMamK重合活性やMamKのATPase活性に与える影響を調べる。また、全反射蛍光顕微鏡および高速原子間力顕微鏡を用いてMamK細胞骨格―マグネトソームの再構成系を観察、解析することで、MamK細胞骨格の機能モデルの構築を行う。
|
