2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K07663
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
金丸 京子 名古屋大学, 生命農学研究科, 講師 (00420365)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | histidine kinase / Aspergillus nidulans / mitochondria / Mito Tracker red / 酸化ストレス / 電子伝達系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モデル糸状菌Aspergillus nidulansの環境応答因子であるHysAの欠損株をMito Tracker Redで染色し、膜電位を発生したミトコンドリアを検出すると、過分極や脱分極を示して膜電位が安定でないこと、その変化が菌糸や分生子の形態形成に大きく影響することを顕微鏡下で観察した。HysAタンパク質は、環境変化に応答して自己リン酸化し、下流の因子にリン酸基を転移することで情報を細胞内に伝達する環境応答機構のセンサータンパク質である。すなわち、HysAは環境の変化に応じてミトコンドリア機能を調節し、糸状菌の正常な生育を促す重要な因子であると考える。そこで本研究では、糸状菌の生育を促進する新たな手段として、HysAを介したミトコンドリア機能調節に着目した。
本年度は、A. nidulansのHysA変異株と野生株において、ミトコンドリア膜電位を複数の定量的手法で比較することにした。ストレス条件での変化も定量評価した。培養条件や菌株による生育速度の違いと膜電位の定量評価が対応するか検討した。
具体的には、① Mito Tracker Red 染色の蛍光強度の数値化 ② ミトコンドリアで合成されるATP量の測定 ③ 電子伝達系で消費される酸素量の測定 ④ ミトコンドリアから遊離するROSによって酸化されたタンパク質の検出 ⑤ 活性を失って断片化したミトコンドリアの割合の5つの方法で定量評価を試みた。
hysA欠損株は酸化ストレス培地での発芽率が野生株の10分の一程度である。継続培養によりhysA欠損株から酸化ストレス耐性株を単離し、その変異部位を同定することで、糸状菌の酸化ストレス耐性にミトコンドリア機能がどのように寄与するかを明らかにすることができる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
28年度の研究計画である、ミトコンドリア機能の定量評価をATP量の測定で行った。ストレス条件下での定量も完成した。生育速度とミトコンドリア機能との関係性も明らかになった。当初の計画にはなかったが、hysA変異株において、なぜ、ミトコンドリア膜電位レベルが低下するか、原因と考えられる遺伝子の発現への影響を明らかにした。また、HysAによるミトコンドリア機能調節が、酸化ストレス耐性に重要であることを示唆する結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
hysA変異株から酸化ストレス耐性株を単離し、耐性を与えた原因遺伝子を同定することで、HysAによるミトコンドリア機能調節についての詳細が明らかになると期待される。麹菌Aspergillus oryzaeにおいて、ミトコンドリア機能が生育や酵素生産に影響するかの解析を進める。
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| Causes of Carryover |
当初購入予定だったルミノメーターについて、所属研究科に設置されている共通機械を使用することが可能になったため、新たに購入する必要がなくなった。研究も計画通りに進み、ルミノメーターを使用するATP量の測定についてはすでに十分な結果が得られた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度後半から来年度において予定していた、hysA変異株から得られる酸化ストレス耐性株の変異部位決定を行う。そのために、次世代シークエンスを行う予定である。麹菌におけるミトコンドリア機能の重要性について理解するために、ミトコンドリア精製や活性測定などの実験方法を確立する。
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