セルロソーム生産菌の多糖類認識・応答による酵素発現最適化機構の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07664
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 黒田 浩一 京都大学, 農学研究科, 准教授 (30432339)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 応用微生物 / 発現制御 / シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

Clostridium cellulovoransは菌体外に「セルロソーム」と呼ばれる酵素超複合体を生産し、バイオマス中の多糖類を高効率に分解することのできる有用微生物である。申請者はこれまでの研究により、本微生物が炭素源となる多糖類の種類に応じて酵素群の発現を最適化させていることを明らかにしてきた。本研究ではC. cellulovoransにおいて、どのタンパク質がどのように多糖類を認識して酵素群の発現制御を行っているか、といった一連の情報伝達・転写制御機構の全体像を分子レベルで解明する。これにより、本微生物のバイオマス分解戦略について新たな知見を見出すとともに、自然に学ぶ形で他の有用微生物に本微生物の分解戦略を導入することによって、広範なバイオマスからの高効率な有用物質生産といった産業面での貢献にもつながる点で意義深い。
C. cellulovoransでは効率よく機能する宿主ベクター系が存在しておらず、遺伝子破壊や過剰発現など遺伝学的手法を用いることができない。このことが転写制御など細胞内制御機構の解明が十分に進展していない要因の一つになっていた。そこで本微生物における宿主ベクター系の確立を試みた。全ゲノム情報を解析した結果、C. cellulovoransにはType Iで1種、TypeIIで2種の制限修飾系遺伝子が存在しており、制限修飾系が働いていることが示唆された。実際にC. cellulovoransの無細胞抽出系を用いてプラスミドDNAを処理すると断片化された。そのため、大腸菌にてC. cellulovorans由来のメチルトランスフェラーゼを発現させ、プラスミドDNAを大腸菌内でメチル化して制限修飾系による切断から保護する、in vivoメチル化システムを構築した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ゲノム解析の結果、C. cellulovoransには幾つかのエンドヌクレアーゼをもつことが予想され、実際に無細胞抽出液によってDNAが断片化されることも分かったが、メチルトランスフェラーゼ発現大腸菌を作製し、大腸菌でのプラスミド複製時にプラスミドをあらかじめメチル化することで形質転換効率の向上が期待される。

Strategy for Future Research Activity

炭素源中の多糖類認識に関わる遺伝子を同定するため、C. cellulovoransを各種多糖類を唯一の炭素源とする培地にて生育させ、多糖類の種類に応じて生産が誘導される菌体外酵素群をプロテオーム解析によって経時的に定量する。これにより多糖類の認識に関わり、情報伝達の上流に位置する因子を絞り込むと同時に、C. cellulovoansによる多糖類分解戦略についても知見を得る。

Causes of Carryover

端数が生じたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の助成金と合わせて使用する。