2017 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the assembly mechanism of mini Golgi apparatus of fission yeast and its application to substance production
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16K07669
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| Research Institution | Kagawa University |
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Principal Investigator |
田中 直孝 香川大学, 農学部, 准教授 (60324109)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 凝集体 / エンドソーム / 分裂酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゴルジ体画分のTOF-MS解析により同定されたタンパク質群の中から配列内にcoild-coil領域を持つ機能未知のタンパク質Gmp1, Gmp2, Gmp3, Gmp4を取得した。本研究では、互いに相同性が高いGmp1, Gmp3, Gmp4に着目し研究を行った。Gmp-GFPを過剰発現させたところ、細胞内の数か所に集約したドットが観察され、凝集体を形成していることが考えられた。その局在を明らかにするため、分泌経路内のオルガネラマーカータンパク質と共発現させたところ、後期分泌経路のオルガネラであるエンドソームにおいて、ゴルジ体への逆行輸送を担っているレトロマー構成タンパク質の一つ、Vps35とGmp1過剰発現時の凝集体の局在が一致した。さらに、Gmp1を過剰発現させていない場合でのVps35と比べ、Gmp1過剰発現時のVps35が凝集体と同等の大きさのドット局在を示したことから、Gmp1の過剰発現によりエンドソーム画分を肥大化していることが考えられた。また、yeast two-hybrid法を用いた相互作用解析の結果、Gmp1, Gmp3, Gmp4がそれぞれ相互作用しており、Gmp1とGmp3, Gmp3とGmp4が相互作用していることが示され、Gmpファミリーが複合体を形成していることが推察された。Gmp過剰発現時の凝集機構を明らかにするため拡散条件を検討したところ、微小管合成阻害剤TBZの添加や、窒素飢餓条件において凝集体が細胞質中に拡散することが観察された。
Gmpファミリーの過剰発現によりエンドソームの肥大化が誘導されることが証明されることで、エンドソームを介した選別輸送の機能促進や、ストレス応答の解明にもつながると予想している。さらに、エンドソームの大きさが変化することによる物質生産の効率化が考えられ、細胞種を超えた物質生産への適用に繋がることが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Gmpファミリーによって形成されるエンドソーム様凝集塊によって、分裂酵母の分泌機能に影響が生じるか確認した結果、分泌糖タンパク質のモデルである酸性ホスファターゼの分泌や糖鎖修飾には殆ど影響が無いことがわかった。また、エンドサイトーシスへの影響をFM4-64の取り込みについて経時的に観察を行ったが、正常に液胞まで到達することがわかった。
本凝集塊は、窒素源飢餓や微小管形成阻害剤、14-3-3タンパク質欠損などにより拡散することから、神経性疾患など病態とも関連する易凝集性タンパク質の形成・分解機構の解明に拡がる可能性がある。gmp1遺伝子破壊株では、他のGmpによる凝集塊が形成されなくなることから、内在性のGmp1は易凝集性タンパク質の形成に重要な役割を果たしていることが推察された。
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| Strategy for Future Research Activity |
エンドソーム様凝集塊の電子顕微鏡解析を行い、凝集形態の詳細な解析につなげたい。また、分泌タンパク質の輸送効率について、種々の糖タンパク質を発現させ、肥大化したエンドソーム様凝集塊の機能を解析する。
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| Causes of Carryover |
(理由) 当初計画していた電子顕微鏡解析の条件検討を年度を超えて慎重に行いたい。また、分子量の大きいモデルタンパク質の構築についても初年度に準備を行う予定だったが、次年度でも支障がないため。
(使用計画) 電子顕微鏡に供するサンプルの選抜と適した条件が決定次第、電子顕微鏡解析を行う。分子量の大きいモデルタンパク質の構築に必要とされる遺伝子工学関連試薬に使用する。
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Research Products
(1 results)
