Geobacter属細菌の細胞外電子伝達ネットワークの解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07671
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 井上 謙吾 宮崎大学, 農学部, 准教授 (70581304)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 鉄還元菌 / Geobacter / 細胞外電子伝達 / シトクロムc

Outline of Annual Research Achievements

鉄還元菌・発電菌として代表的なGeobacter sulfurreducensの標準株であるPCA株は鉄還元菌による細胞外電子伝達にはOmcB、OmcS、OmcZなど複数種のc型シトクロムが必要であり、それらが細胞外膜周辺に局在して電子を細胞外へ伝達する。本研究ではそれらc型シトクロム同士の相互作用について詳細を明らかにすることを目的とする。＜OmcZLの精製＞　微生物燃料電池で高い出力での発電に必須なOmcZは、ぺリプラズムでは水溶性の高い50 kDaのシトクロムOmcZLとして存在するが、その後、プロテアーゼOzpによる切断を受けて30 kDaの水溶性の低いOmcZSになる。OmcZLの大量発現系を構築するため、ompJプロモーター配列をヒスチジンタグを付加したOmcZ遺伝子全長の直上流に配置し、その下流にはゲンタマイシン耐性遺伝子を連結した断片をデザインし、さらにゲノム中にノックイン（相同性組換えによる）するために、その断片の両端にシュードジーンであるGSU2204の上流と下流の遺伝子断片で挟んだDNA断片を作製した。作製したDNA断片を用いてエレクトロポレーション法によって、ozp遺伝子破壊株（OmcZSを生産できず、OmcZLが蓄積する）への導入を試みている。また、omcZのゲノムへのノックインによる過剰発現以外にもプラスミドベクターを用いた発現系の構築も同時に進めており、プラスミドの構築が完了した。＜共免疫沈降法によるシトクロムの相互作用解析＞　OmcZSをOmcZ過剰発現株（ZKI株）から大量に調整し、界面活性剤抽出法によって大量精製を行った。精製したOmcZSを抗原として抗OmcZ抗体を外注により作製した。市販の共免疫沈降-タンパク質複合体精製用キットを用いてOmcZと相互作用するタンパク質について、網羅的な解析を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

OmcZLの発現系がほぼ完了し、その精製のためのFPLCを運転する段階にある。OmcZとの相互作用タンパク質の解析においても、共免疫沈降を実施できる状況にあり、近日中に新しい知見が得られると予想される。

Strategy for Future Research Activity

OmcZL過剰発現株からFPLCを用いてOmcZLを精製する。精製したOmcZLを用いて、サイクリックボルタンメトリーによる電気化学的特性を明らかにする。また、同様の手法によってOmcS、OmcBについても精製酵素を調整する。抗OmcZ抗体を用いた共免疫沈降を実施し、OmcZと相互作用するタンパク質を同定する（SDS-PAGEによる泳動後、バンドを切り出してMALDI-TOF/MS解析）。