2017 Fiscal Year Research-status Report
単細胞性真核紅藻における複製開始点の同定とそれを利用した人工染色体の構築
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16K07675
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
渡辺 智 東京農業大学, 生命科学部, 准教授 (10508237)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA複製 / 複製開始 / ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞はDNA複製の開始を厳密に制御することで染色体コピー数を正確に維持している。真核生物では各染色体に複数存在する複製起点より複製が開始される。酵母や動物では複製開始機構が詳細に解析されている一方で、光合成を行う藻類や植物ではDNA複製の開始制御に関する知見は限られている。Cyanidioschyzon merolae (以下シゾンと呼ぶ)は温泉などの高温、強酸性下に生息する単細胞性真核紅藻である。原始的な細胞構造、ゲノムを有しており、植物の基本的な細胞機能を解析するモデルとして期待されている。また近年、単細胞性の真核藻類は有用物質生産のホストとしても注目されている。本研究ではシゾンの複製開始機構の解明と、それを利用した新規ベクター系の開発を目的として研究を進めている。
複製開始領域に結合することが報告されているORC2タンパク質に着目し研究を進めた。これまでに内在性のプロモーターよりHAタグと融合したORC2（ORC2-HA）を発現するシゾン株を樹立した。当該年度では本株を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）および次世代シーケンス（以下、ChIP-seq解析）によるORC2結合領域の探索を行った。明暗処理により細胞周期を同調し、S期の細胞についてORC2-HAのChIP-seq解析を実施した。その結果、ネガティブコントロールである親株と比べてORC2-HAの結合シグナルを検出した。しかし、同様のChIPサンプルを用いた定量PCRでは有意な差が確認できなかった。次世代シーケンスはサンプル調整の際にPCR反応を要するため、 ChIP-seq解析で検出したシグナルはPCRバイアスに起因すると考えられる。現在、PCRバイアスの少ないタイリングアレイを用いたChIP-chip解析を進めると共に、細胞周期の各フェーズでのORC2の結合様式の違いについて比較、解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ORC2のChIP-seq解析について課題が見つかり、解析方法を修正すべきことがわかったため。しかし、タイリングアレイを用いたChIP-chip解析の予備実験では、有意にORC2-HAが結合していると判断できる領域も得られており、今後さらなる研究の進展が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はORC2-HAの発現株を用いてChIP-chip解析を行いORC2が特異的に結合する領域の探索を進めると共に、ChIPサンプルの定量PCRにより結合領域の同定を進める。また細胞周期の各フェーズ（G1期、S期、G2/M期）でのORC2の標的領域への結合を確認し、複製開始領域についてさらに情報を収集する。すでにORC2-HAの過剰発現株についても構築しており、本株においても候補領域の結合の有無を確かめる。収集された情報をもとに人工染色体構築に向けたベクター構築を開始する。既にセントロメア領域を含むベクターは構築済みであるため、これに複製開始点の候補領域をクローニングする。得られたベクターをシゾン細胞へと導入して、複製の活性を比較する。
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| Causes of Carryover |
ほぼ予定通りの支出であったが、端数が生じたため、その金額を次年度使用額に組み入れた。次年度においては端数を含め、計画通りの使用を予定している。
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Research Products
(1 results)
