2016 Fiscal Year Research-status Report
糸状菌における鉄恒常性維持の主要制御因子HapXによる転写誘導・抑制の分子機構
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16K07679
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
加藤 雅士 名城大学, 農学部, 教授 (70242849)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
志水 元亨 名城大学, 農学部, 助教 (20423535)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 鉄のホメスタシス / 糸状菌 / 転写因子 / HapX / CCAAT / 転写抑制 / Hap複合体 / 鉄硫黄クラスター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1)HapXとの相互作用因子の候補の選抜：予備検討において、誘導プロモータ（alcA promoter)を用いてTAPタグ（Tandem Affinity Purification Tag)を融合したHapXをhapX欠失株内で過剰発現する系を構築したが、誘導に伴い生育が悪くなり、解析が困難であることが判明したため、hapXのネイティブプロモータを利用した系を構築した。本コンストラクトでは、鉄欠乏条件下でHapX依存のプロモータが正常に抑制されたため、この組換えHapXは正常に機能していることが分かり、相互作用因子のスクリーニングに取りかかった。TAPタグを用いた2段階アフィニティー精製を行った結果、HapXと相互作用することが予想される複数のタンパク質が検出された。
2）相互作用因子候補タンパク質の同定：1)で得られた画分の電気泳動ゲルから候補タンパク質のバンドを切り出し、質量分析器およびMASCOT解析により2種類のタンパク質が同定された（ANXXXX, ANYYYY : 論文による発表がなされるまでは，同因子が識別できる名称の公表は控える）。
3) HapXとの相互作用の検証：まず、in vitroでの相互作用の検証のため、上記の2種類の因子に関して、大腸菌を用いた組換えタンパク質の調製を試みた。ベクターの構築を終え、タンパク質発現に関する検討を進めている。この後、すでに作成してあるリコンビナントHapXを用いてのプルダウンアッセイやEMSAの系に添加することによる相互作用検出系を試みる。
4）ChIPアッセイの予備検討：用いるプロモータの増幅のためのプライマーの検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1）相互作用因子の同定のための系が構築できたこと。
2）相互作用因子の候補が複数見つかったこと。
3）そのうち2つの因子が同定できたこと。
4）それらの因子のリコンビナントタンパク質の発現系が構築できたことにより、in vitroでの相互作用解析系の準備が進んだこと。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画に沿って、着々と研究を進める。相互作用の解析については、先にin vitro解析を行っているが、並行してin vivoでの解析の計画を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
年度末に11,515の残額が発生したが、次年度には抗体などの高額な消耗品の使用が予測されたため、研究費の有効利用のため、次年度に使用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
遺伝子操作用の試薬や抗体などの消耗品として使用する。
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