2016 Fiscal Year Research-status Report
小孔形成レクチンを基盤とした細胞傷害能を有する新規機能性分子の構築
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16K07685
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| Research Institution | Ibaraki University |
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Principal Investigator |
上妻 由章 茨城大学, 農学部, 教授 (10284556)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中島 崇 九州大学, 農学研究院, 助教 (20380553)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 小孔形成レクチン / ガン細胞傷害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、小孔形成能を有するレクチンであるCEL-IIIを基盤分子として、ガン細胞除去などの応用が考えられる新規細胞傷害性機能性分子を創出することを目的に、１）CEL-IIIの小孔形成能の制御系の構築、２）ランダム変異等の導入によるCEL-III の糖結合特異性の改変、および、３）１と２を組み合わせた新規なガン細胞特異的傷害性CEL-III 分子の創出を行う。
今年度は、まず上記１）の小孔形成能制御のために、CEL-IIIへのジスルフィド(SS)結合の導入による還元剤(GSH)活性型CEL-IIIの作製を試みた。分子モデリングの結果から、CEL-IIIの糖認識ドメイン(CRD)と小孔形成ドメイン(PFD)間にCys残基を導入した変異体(I10C/S348C及びY155C/VS328C)、及びPFD中の2つのα-ヘリックス間にCys残基を導入した変異体(W286C/T329C、I330C/VS350C、E331C/VS350C及びV341C/V345C)の発現系を構築した。変異体タンパク質の発現、精製を試みたが、一部の変異体については発現量が少なかったので、十分量が精製された変異体について、GSHの存在、非存在下で溶血活性を測定した結果、GSH非存在下でも、ある程度の溶血活性を保持していることが明らかになった。
次に上記２）糖特異性の改変については、CRD1のアミノ酸残基をランダムに変異したCRD1ライブラリーの作製を試みた。まず、特定アミノ酸残基にランダム変異が導入されたロングプライマーを用いてPCRで遺伝子を増幅し、これをファージディスプレイ用ベクターに連結して大腸菌に導入した。これまでに、サイズとして、10万ほどのライブラリーが構築できたので、各種ガン化細胞株(U937、他）を用いて、ガン化細胞株特異的なCRD1変異体のスクリーニングを行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究内容１）の小孔形成能制御のために、CEL-IIIへのジスルフィド(SS)結合の導入による還元剤(GSH)活性型CEL-IIIの作製を試みたが、タンパク質の発現量が少なかったため、一部の変異体については、GSH存在、非存在下における測定が行えず、また、測定できた変異体についても、GSH非存在下において、ある程度の活性を保持していることが明らかになった。このことから１箇所のSS結合の導入では、溶血活性の制御が行えない可能性が示唆されており、今後、複数のSS結合の導入を行う必要があると思われる。上記２）糖特異性の改変については、これまでのところ順調に計画が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度以降の研究推進の方策としては、まず、１）の小孔形成能制御のために、複数のSS結合を導入したCEL-III変異体を作製して、還元剤（GSH）非存在下では溶血活性を示さず、GSH存在下で溶血活性を発揮するCEL-III （GSH-activated CEL-III: GA-CEL-III）を作製する。また、２）CRDを用いた糖特異性の改変によるガン化細胞特異的CRDの構築については、H28年度に作製した変異CRD1分子ライブラリーを用いて、それが表面に発現された組換えファージを作製し、各種ガン化細胞株（U937、K562、Jurkat、HeLaなど）と結合させ、酸性緩衝液などの溶離液で溶出してくるファージを回収し、再び、結合、溶出を行ない（パニング）、このサイクルを数回繰り返すことで、ガン化細胞株特異的なCRD1変異体（Cancer-specific CRD：CS-CRD1）を選抜する。
つづいて、それまでの実験によって得られたCS-CRD1、GA-CEL-III について、両者を組み合わせた変異体CEL-III（CSGA-CEL-III）を発現し、様々な活性等(細胞結合、細胞傷害、他）を検討する。
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| Causes of Carryover |
変異体作製実験において、その作製が遅れてしまったことにより、幾つか予定しておいた実験に関して、器具や試薬等を購入するための費用としての支出ができなかったことと、その遅れにより論文としての報告や学会発表などを行うことができなかったので、旅費等の支出ができなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H29年度にも、H28年度に行った変異体作成実験を行って、作製した変異体についての様々な活性測定など、H28年度に予定していた実験を行う予定である。また、H29年度に当初から計画していた実験についても予定どおり遂行し、学会発表なども行う予定であるので、次年度使用額を合わせた研究費をH29年度は使用する予定となっている。
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