2017 Fiscal Year Research-status Report
溶血性レクチンの膜孔形成におけるダイナミックな構造変化の解明
| Project/Area Number |
16K07695
|
|---|
| Research Institution | Nagasaki University |
|---|
Principal Investigator |
郷田 秀一郎 長崎大学, 工学研究科, 准教授 (00346587)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | レクチン / 孔形成毒素 / 溶血性 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
海産無脊椎動物グミ（Cucumaria echinata）は溶血性レクチンCEL-IIIをもち、CEL-IIIは糖結合ドメインであるドメイン１，２及び溶血活性に関与するドメイン３からなる。溶血活性はCEL-IIIが細胞表面の糖鎖と結合した後に七量体化し、イオン透過性の孔（ポア）を形成することによって起こる。孔はβバレル構造であり、単量体で存在するときは同部位はαヘリックスとなっている。孔形成時にβバレル構造以外での単量体間の相互作用が見られることから、七量体化の初期の構造変化にβバレル部位以外が関与していることが考えられた。そこで、本研究では、ドメイン3のβバレル形成部位（Stem部位）を欠損した変異体を作成し、その七量体化について解析した。
Stem部位欠損変異体は大腸菌を宿主に用いて生産した。得られた欠損変異体の構造及び大きさはX線小角散乱(SAXS)測定によって解析した。その結果、欠損変異体のギニエ半径(Rg)は101.5 Åで、野生型の単量体時より著しく大きく、多量体化していると示唆された。また、CEL-IIIは、pH10.0、ラクツロース及びカルシウム存在下で溶液中でも多量体化することから、pH10.0で測定すると変異体のRg は80.7 Å、さらにラクツロースを加えると69.9 Åとなった。SAXS測定よりモデル構造の構築を行うと、欠損変異体は野生型が七量体を形成した構造から膜貫通部位を除いた構造に近く、Stem部位が存在しなくても多量体化することを示した。また、その多量体構造は糖、カルシウムを加えることによってコンパクトな七量体へと構造変化し、糖・カルシウムが糖結合ドメインの構造に影響を与えていることを示した。このことから、Stem部位欠損CEL-IIIは多量体を形成し、ドメイン1,2が多量体化にも寄与していることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度までに得られていたＸ線小角散乱測定の結果から、本年度はモデル構造の構築に成功した。モデル構造は、野生型七量体から膜貫通部位を除いたものに近く、Stem部位を欠損すると、通常の状態でも七量体化することを示した。このことは、膜貫通部位以外の相互作用によって多量体化が可能であることを示唆している。すなわち、本タンパク質の膜孔形成多量体化は、同タンパク質が膜表面の糖鎖を認識して結合し、その後、ドメイン１，２間の相互作用によって七量体を形成する。そのうえで、膜貫通部位の相互作用によって膜孔の形成が起こるものと示唆された。本結果は、同タンパク質の膜孔形成機構の解明に大きな知見を与えるものであり、おおむね順調に進展しているものと判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
欠損変異体はStem領域を除いたもののみならず、さらに2種類のより多くの部位を欠損したものを作成している。それらの欠損変異体の構造を解析することによって初期の多量体化に寄与してる部位を同定することが可能となる。そこで、さらなる欠損変異体の作成、Ｘ線小角散乱測定を行う。
すでにＸ線小角散乱測定によって構造を解析しているStem領域欠損変異体に関しては、その機能解析を行う。赤血球を用いた溶血活性、凝集活性を測定し糖結合特性を有しているか解析する。膜貫通部位を欠損していることから、溶血活性を失われていることが予想される。そこで、赤血球表面から欠損変異体を回収し、その構造解析を行う。
|
| Causes of Carryover |
（理由）おおむね申請通りに支出した。
（使用計画）物品費、旅費に関しては、申請通りの支出を予定している。
|
