2017 Fiscal Year Research-status Report
均一な糖鎖を持つバイオ医薬品の微生物酵素を用いた革新的生産技術
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16K07698
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| Research Institution | Ishikawa Prefectural University |
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Principal Investigator |
山本 憲二 石川県立大学, 生物資源環境学部, 特任教授 (70109049)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 紀彦 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40724612)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | バイオ医薬品 / 糖鎖 / エンドグリコシダーゼ / 糖転移反応 / エンド-M / インターロイキン-3 / Pichia pastoris / インターフェロン-γ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト由来インターフェロン-γ（IFN-γ）の遺伝子をメタノール資化性酵母Pichia pastorisにより発現し、得られた組換えIFN-γの糖鎖のヒト型糖鎖へのリモデリングを試みて、発現した糖タンパク質の糖鎖の切断遊離をEndo-Hにより行ったが、得られたN-アセチルグルコサミン残基を有するIFN-γに対するEndo-MのN175Q変異酵素によるヒト型糖鎖への糖転移付加反応が進行しなかった。そこで、サイトカインのモデル糖タンパク質として骨髄幹細胞を刺激するインターロイキン-3（IL-3）について、酵母により発現したIL-3のヒト型糖鎖へのリモデリングを試みた。先ず、IL-3のアミノ酸配列から酵母発現用に塩基配列を最適化して外注した合成DNAをpUC57に挿入したプラスミドを大腸菌DH5αに形質転換し、培養後に抽出したDNAを鋳型としてPCRによりIL-3遺伝子を増幅した。次に、目的タンパク質を菌体外に発現させるためにα-FactorをN-末端側に、His-tagをC-末端側に付加するように設計した酵母用ベクターpPICZαAに、この遺伝子をInfusion法で導入し、Pichia pastoris KM71株へエレクトロポレーション法により形質転換した。形質転換株をメタノール含有培地で培養して、IL-3の発現誘導に成功した。発現した組換えIL-3にEndo-Hを作用して高マンノース型糖鎖を切断遊離し、一残基のN-アセチルグルコサミンを含有したIL-3を得て、MALDI-TOF-MS分析により確認した。これを受容体とし、ヒト型糖鎖であるシアロ複合型糖鎖を有する糖ペプチドを供与体としてEndo-M-N175Q変異酵素の糖転移活性によりシアロ糖鎖の転移付加を試みてシアロ糖鎖に特異的なSNAレクチンを用いたLectin blottingで糖鎖のリモデリングを調べている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Endo-Mの変異酵素の糖転移活性を用いることにより、酵母によって発現生産した組換え糖タンパク質の糖鎖をリモデリングしてヒトに適応したヒト型糖鎖を有するバイオ医薬品を得るという目的で、インターフェロン-γを対象とした糖鎖のリモデリング技術開発を試みたが、ヒト型糖鎖への変換に成功することができなかった。そこで、糖鎖リモデリングの対象をインターロイキン-３に変えた。現在、酵母による組換え糖タンパク質の発現には成功したが、糖鎖のリモデリングに難航している。しかし、バイオ医薬品であるインターロイキン-３やインターフェロン-γなどのバイオ医薬品の酵母による生産に成功するなどの成果を挙げることができた。今後はEndo-Mの変異酵素を用いた糖鎖のリモデリングの技術開発に注力することで、一応、全体的には目的に沿った形で研究は進行している。当初、計画していたコアフコースを含有するN-型糖鎖に対して作用するEndo-Mの変異酵素の取得については計画を先送りした。
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| Strategy for Future Research Activity |
酵母Pichia pastorisによって発現したバイオ医薬品のインターフェロン-γおよびインターロイキン-３の糖鎖のリモデリングを主として行う。現在、Endo-M-N175Qによる糖鎖の転移付加が成功していないので、その原因を探るためにさまざまな反応条件下において糖転移活性による酵素反応を行って、糖鎖の転移を検証する。さらにEndo-Mの分子サイズによる基質への立体障害をも想定して、そのサイズを小さくする試みをも行う。今年度はこれらのことがらについて研究を実施するとともに昨年度に実施を先送りしたコアフコースを含有するN-型糖鎖に対して作用するEndo-Mの変異酵素の取得と変異酵素についての諸性質を調べる。本研究の総括としてまとめの論文を作成することを本年度の目標とする。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は、当初、コアフコースを有するN-結合型糖鎖に作用するEndo-M変異酵素を取得することを計画していたが、準備不足のために研究を先送りした。そのために本年度にこの研究に使用を予定していた経費を次年度に回した。次年度の３０年度に本研究を遂行する予定であり、経費を使用する計画である。
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[Journal Article] Chemo-enzymatic synthesis of the glucagon containing N-linked oligosaccharide and its characterization.2018
Author(s)
Higashiyama, T., Umekawa, M., Nagao, M., Katoh, T., Ashida, H., Yamamoto, K.
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Journal Title
Carbohydrate Research
Volume: 455
Pages: 92-96
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Glycosylation engineering of therapeutic IgG antibodies: challenges for the safety, functionality and efficacy.2018
Author(s)
Mimura, Y., Katoh, T., Saldova, R., O’Flaherty, R., Izumi, T., Mimura-Kimura, Y., Utsunomiya, T., Mizukami, Y., Yamamoto, K., Matsumoto, T., Rudd, P.M.
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Journal Title
Protein & Cell
Volume: 9(1)
Pages: 47-62
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Specificity of donor structures for endo-beta-N-acetylglucosaminidase-catalyzed transglycosylation reactions.2018
Author(s)
Ishii, N., Ogiwara, K., Sano, K., Kumada, J., Yamamoto, K., Matsuzaki, Y., Matsuo, I.
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Journal Title
ChemBioChem,
Volume: 19
Pages: 136-141
DOI
Peer Reviewed
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