2018 Fiscal Year Annual Research Report
Innovative technique for production of biomedicines with uniform sugar chains by use of microbial enzymes
| Project/Area Number |
16K07698
|
|---|
| Research Institution | Ishikawa Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
山本 憲二 石川県立大学, 生物資源環境学部, 特任教授 (70109049)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 紀彦 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40724612)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | バイオ医薬品 / 糖鎖 / エンドグリコシダーゼ / エンドーＭ / 糖転移反応 / インターロイキン３ / Pichia pastoris / インターフェロンーγ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はバイオ医薬品である糖タンパク質のヒト由来サイトカインを組換え酵母で発現させ、得られた酵母型の糖鎖を有する糖タンパク質を糸状菌のエンドグリコシダーゼ（Endo-M）の糖転移活性を用いてヒト型糖鎖へリモデリングすることにより、ヒトに適応したバイオ医薬品を創製することを目的とする。これまでにヒト由来インターフェロン-γ（IFN-γ）およびインターロイキン-3（IL-3）について、それぞれの合成DNAを用いてPichia酵母による組換えサイトカインの生産に成功している。得られた組換えサイトカインの糖タンパク質の糖鎖にEndo-Hを作用して酵母特有の高マンノース型糖鎖を切断遊離し、N-アセチルグルコサミン一残基を有したサイトカインを得て、これを受容体としてヒト型糖鎖であるシアロ複合型糖鎖を有する糖ペプチドを糖鎖供与体としてEndo-M変異酵素の糖転移活性によりシアロ糖鎖の転移付加を試みた。しかし、シアロ糖鎖特異的なSNAレクチンを用いたLectin blottingで調べた結果、糖転移生成物をほとんど見出すことができず、リモデリングに成功していない。この結果はEndo-Mの分子サイズが大きいために受容体の目的の作用部位に作用することができないためと考え、Endo-Mのサイズを縮小化するために744アミノ酸残基からなる完全長のEndo-MからC末端を部分的に削除した組換えEndo-Mの作成を試みた。すなわち、G581までをコードするdeletion mutantとE546までをコードするdeletion mutantのコンストラクトを構築した。G581およびE546をコードするコドンから逆向きに2つのプライマーを設計し、またHisタグをコードする領域から順方向にプライマーを設計して、これらのプライマーを用いて全長Endo-Mを含むpET23dベクターを鋳型として加えPCRを行い、得られた断片をそれぞれセルフライゲーションして、２つのコンストラクトを得たが、いずれも活性が消失していてEndo-Mのサイズの縮小には成功しなかった。
|
Research Products
(4 results)
-
-
[Journal Article] Bifunctional properties and characterization of a novel sialidase with esterase activity from Bifidobacterium bifidum2018
Author(s)
Ashida, H., Tanigawa, K., Kiyohara, M., Katoh, T., Katayama, T., Yamamoto, K.
-
Journal Title
Bioscience, Biotechnology and Biochemistry
Volume: 82
Pages: 2030-2039
DOI
Peer Reviewed
-
-
