2016 Fiscal Year Research-status Report
アルカロイド生産におけるウラシル輸送体の生理的役割と一次代謝維持機構の解明
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16K07702
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
士反 伸和 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (20547880)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アルカロイド / ウラシル輸送体 / 一次代謝 / 二次代謝 / タバコ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の一次・二次代謝物は、様々な代謝物がオルガネラ間を動きながら、複雑な代謝経路を経て生合成されている。しかし、細胞内の輸送機構や、それら輸送能が一次・二次代謝生産に及ぼす影響などは殆どわかっていない。本研究では、タバコアルカロイド生産と共発現する色素体へのウラシル輸送体を過剰発現、発現抑制する培養細胞や毛状根を作出する。これら形質転換体のアルカロイド生産をon/offした際の代謝物変化を網羅的に解析し、アルカロイド生産時におけるウラシル輸送体の生理的役割と一次代謝の維持機構を解明する。これら研究から、より効率的なアルカロイド生産系に繋がる基礎的知見を得る。
本年度は、すでに作出していたウラシル輸送体を恒常的に過剰発現する毛状根を用い、メタボローム解析の条件決定と過剰発現によって変動している代謝産物の同定を試みた。その結果、Orbitrap（Thermo社）を用いたメタボローム解析としてLC条件やMS条件をおよそ決定することができた。さらに、コントロールおよびウラシル輸送体の過剰発現の毛状根を液体培地で培養後に代謝産物を抽出し解析したところ、コントロールに比べて細胞内含量が有意に増減している約30のピークを検出した。標品の関係で化合物として同定できたものは少ないが、その中にはm/zや保持時間から、一次代謝産物としてアミノ酸や、二次代謝産物としてタバコアルカロイドと考えられるものも含まれていた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
一昨年に暴走した（温度の異常な低下）植物培養装置とは別の培養装置が昨年に暴走し（温度の異常な上昇）、植物サンプルの復旧などに時間と労力がかかり、やや遅れています。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、アルカロイド生合成酵素と共発現するウラシル輸送体を、誘導プロモーターにより過剰発現、発現抑制するタバコ培養細胞、毛状根を作出し、それらを化合物処理してアルカロイド生産をon/offさせた際の網羅的な代謝産物の同定と定量による解析を目指している。上記のようにメタボローム条件などを決めてきたが、一方で分子生物学的なベクター構築などが少し遅れているため、今後は誘導プロモーターで過剰発現、発現抑制するベクターを急ぎ構築する。さらに形質転換した培養細胞、毛状根を作出し、誘導条件下、ウェスタンブロットにより実際に発現が増減している形質転換体を選抜する。その上で、それら形質転換体における代謝産物を定性・定量的に評価し、また有意に増減している代謝産物の同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
植物培養装置の故障などで、研究が少し遅れたことが、若干の差額が生じた理由になります。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究の遅れを取り戻すため、実験補助などをお願いし、より効率的に研究を進めていくことを計画しています。
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