2017 Fiscal Year Research-status Report
生物活性環状ペプチドPF1171類の生体内における立体配座解明と標的分子同定
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16K07707
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
増田 裕一 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (90617755)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 有機化学 / 環状ペプチド / カイコ / 立体配座 / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
環状ペプチドPF1171類は、カイコに対して経口投与で麻痺を引き起こす。環状ペプチドの立体配座は活性発現と密接に関係していることから、生体環境中ならびに標的分子結合時の立体配座の解明は、高活性類縁体の合理的設計につながる。本研究では、PF1171類を安定同位体標識して生体環境中での立体配座を核磁気共鳴（NMR）により解析するとともに、アフィニティー精製や光親和性標識法を用いてPF1171類の標的分子を同定することにより、PF1171類がどのような立体配座をとることによりカイコ体内を巡り、標的分子と結合するかを解明することを目的としている。
H28年度に、アミドプロトンの選択的NMR解析に用いる15N標識PF1171Fの合成を達成した。H29年度は、本標識体をリン酸緩衝液（カイコ血液と同じpH6.8）に溶解し、1H-15Nの二次元相関NMRを測定した。本測定には800 MHzのNMR装置を使用し、1H-15Nの二次元相関スペクトルを高感度で測定できるSO-FAST法を用いた。その結果、主に3組の化学シフトが観測され、PF1171Fのリン酸緩衝液中の主要な立体配座が3種類あることが判明した。これらの化学シフトは重クロロホルム中のものと大きく異なっていたことから、PF1171Fが有機溶媒と水系溶媒で全く異なる立体配座を形成していることが明らかとなった。一方、本標識体をカイコ血液に溶解して同様のNMR測定を行ったが、1H-15N相関ピークは観測されなかった。その原因の一つとして、PF1171Fが血液中の何らかの巨大分子に結合しているため、NMRシグナルの緩和が非常に速くなっていることが考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
15N標識体PF1171Fの疑似生体環境中でのNMR解析を完了し、研究目標の一つを達成した。しかしながら、もう一つの研究目標であるPF1171Fの標的分子同定については、アフィニティー精製や光親和性標識法に用いる分子プローブの合成は完了しているものの、標的探索実験には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
PF1171Fの疑似生体環境中での立体配座のNMR解析の結果については、データを補足して学会および論文発表を行う。
標的分子探索を目的としたPF1171Fの標的探索に着手する。本研究代表者はこれまで、MeLeu残基の側鎖にアジド基を導入したPF1171Fがカイコ麻痺活性を維持していることを報告している。さらに、末端にアルキンを有するビオチンフラグメントをクリックケミストリーにより連結することにも成功した。H30年度は、合成したPF1171F-ビオチンプローブをアビジンアガロース樹脂に固定化したアフィニティー樹脂を作製し、標的タンパク質の精製を行う。タンパク質溶液は、カイコの培養細胞もしくカイコの表皮を除いた部分の細胞破砕液を用いる。アフィニティー精製の後、得られたPF1171F結合タンパク質をSDS-PAGEにより分離する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
H29年度はPF1171Fの疑似生体環境中での立体配座のNMR解析に集中したため、標的分子探索に用いる試薬・器具の購入をH30年度に行うことにしたため。
（使用計画）
標的分子探索に用いるアフィニティービーズ、電気泳動の器具および試薬、生体試料の購入費に充てる。分離したタンパク質の同定に用いるMALDI-TOF-MSおよびデータベースの機器使用料に用いる。
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Research Products
(8 results)
