2016 Fiscal Year Research-status Report
大豆サポニン分子種の迅速・高効率精製ならびに亜鉛欠乏改善効果など健康機能性の解析
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16K07742
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
高橋 正和 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (80315837)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片野 肇 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (50264685)
神戸 大朋 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (90303875)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ソヤサポニン / 簡便精製法 / 腸管細胞 / 亜鉛トランスポーター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに多様な生理活性を示す大豆サポニンBbを，粗精製サポニンから得る迅速簡便法をすでに確立している（Anal. Sci. 2015）．本研究では，この手法を発展させ大豆全粒粉末（タンパク質35%，脂質20%，糖質20%などを含む）から簡便に得る手法を開発した．①まず大豆全粒粉末からメタノール抽出物を調製し，②次にホウ砂水溶液と接触させて得られた上澄みに酸を添加して沈殿画分を回収し，③最後に同沈殿を1-オクタノールで洗浄した．こうして得られた精製標品には，ソヤサポニンBb以外には１～２種の化合物しか含まれず，その１つは質量分析(m/z = 767)からソヤサポニンBc’と推定された．また同様に黒豆や緑豆から大豆とほぼ同様の精製度を示す標品が得られた．以上の手法を用いて，最終的に大豆全粒粉末100gから大豆サポニンBb含量の高いサンプル29 mg を得た．最終精製はHPLCで行い， 5mgのソヤサポニンBb と 約1 mg弱のソヤサポニンBc’ならびに関連化合物の単離に成功した．
ところで，大豆サポニンBbは亜鉛トランスポーターZIP4（腸管吸収に必須）の誘導活性を示し，他の各種サポニン分子にも同様の活性が期待されるが，従来の評価系には肝臓系細胞株を用いなければならない欠点があった（理由：腸管系細胞株ではZIP4が発現していない）．そこで，マウス腸管細胞の三次元培養系（オルガノイド培養系）を構築し，得られたオルガノイドの内腔側（消化管側）へ各種サポニン分子をマイクロインジェクションして，亜鉛取込上昇を特異蛍光プローブで検討するべく，培養系の構築を行った，次年度に評価を行う．また前述の評価系の欠点を補うため，別の亜鉛トランスポーターZNT-1の抗体を構築した．ZNT-1はCaco-2など腸管系細胞でも発現しており，各種サポニン分子の生理作用確認に役立つと期待される．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の最大の目標であった大豆全粒粉末からの大豆サポニンBbの直接精製法の確立に成功し，精製標品を得た．今後も同様の精製を繰り返せば精製標品は継続的に得られる．またマイナーな大豆サポニンBc’の精製にもめどが立った．今回確立した手法は簡便であり，翌年度に精製量を増やすことが可能と考えられる．また，さらに大豆以外にも黒豆や緑豆においても同様の精製法で大豆サポニンBbと思われる分子が精製できる系を確立できた．これらについても，今後必要に応じて大量調製が可能となった．
一方，本年度はZIP4発現誘導活性などすでに確立している評価法による検討は行わなかった．食成分が直接接触するのは腸管細胞であるが，これまで使用してきた評価系では肝臓系細胞を用いなければならないという欠点が存在するためである．そこで，本年度は腸管細胞を用いた評価系の確立を優先することに計画を変更し，オルガノイド培養系とインジェクションの準備，さらに新しく腸管細胞評価に適した抗体を構築することに成功した．2年目はこれらを用いて生理作用を評価し，大豆サポニンBbだけでなく，マイナーな分子種の評価も行う準備が整った．以上より，おおむね順調に進展していると，判断した．
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| Strategy for Future Research Activity |
計画通り，比較的マイナーな大豆サポニン分子種である，大豆サポニンBc’の大量調製を行い，生理作用評価の準備を整える．また，他の天然素材として，大豆に含まれるイソフラボン配糖体などについても精製条件を検討中である．
一方，本年度はマウス腸管細胞の三次元培養系（オルガノイド培養系）系において，得られたオルガノイドの内腔（消化管側）へ各種サポニン分子をマイクロインジェクションして機能評価を行う．亜鉛取込上昇の確認には特異的蛍光プローブを用いるが，こちらは細胞膜透過型のプローブを細胞会の外側から浸透させることを考えている．またこれらの評価系と同時に，従来の肝臓系細胞Hepa細胞を用いたZIP4発現誘導活性もWesternブロッティング法により実施予定であり，新しい評価系との相関性の確認が行えると考えている．またさらに，新しく得られたZNT-1の抗体を用いて，腸管系細胞への各種サポニン分子種の生理機能性表を検討予定である．
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| Causes of Carryover |
新たに腸管系細胞を用いた評価系の構築に踏み切ることにし、その構築を優先したが、その培養系の構築やマイクロインジェクションの設備（インジェクター自身は学内予算で購入）の整備に時間がかかり、機能評価が遅れた。このため年度末に無理に予算執行せず、翌年度の生理機能評価に充てることにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画通り、機能評価にかかる費用にあてる。（オルガノイド培養には、高価な試薬が必要となるため、その購入予算に充てる）
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