麹醗酵を利用した血圧降下物質の調製 ～効率的な生産法の開発～

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07757
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 米谷 俊 近畿大学, 農学部, 教授 (70503449)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 麹醗酵 / きなこ / 大豆 / 血圧降下作用 / 効率化

Outline of Annual Research Achievements

これまで、（株）向井珍味堂から提供されたきなこ醗酵エキス（きなこを醤油麹で室温、90日間醗酵させたもの）をエタノールで脱塩し、これを脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット（SHRSP）に経口投与したところ、強い血圧降下作用を示した。但し、本醗酵エキスは、生成に長期間（90日）かかること、その間の醗酵が充分制御されていないこと、このためコンタミネーション防止を目的に多量のNaClを使用し、醗酵終了後に脱塩の必要があることなどから、機能性食品素材として応用するには、解決すべき課題が多い。また、麹醗酵を用いた同様の研究が数多くされているが、同様の課題があり、実用化には至っていない。 麹醗酵は、日本の伝統的な技術であり、大手企業や中小企業においても高い技術を有している。そこで、この技術を用いた生理活性物質の製造法が実用化できれば、日本の食品産業の発展のみならず、地方産業の活性化にも繋がると考えた。
本研究では、「醗酵」を麹菌が分泌する各種の酵素が行う化学反応と捉え、（酵素が失活しない範囲で）温度が10℃上昇すれば、反応速度は2倍になり、生理活性物質の生成も効率的に行われる。反応期間が短縮できれば、その制御もしやすくなり、NaCl量の減少や不使用も可能となる。きなこの麹醗酵を例として、機能性物質が効率的に生成し、Autofocusing（調製型電気泳動）法で、動物試験に対応できる多量のサンプルを調製できる手法を確立すれば、日本独自の機能性研究が進展すると考えている。
本研究では、in vitroで目標通り高い活性（angiotensinⅠ converting enzyme;ACEの阻害活性）を示すサンプルが獲得できたが、in vivoでは、有意な活性を確認できなかった。醗酵時間を延長し、in vitroでは再度期待通りの結果を得ているので、次に、in vivoの検討を実施する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Autofocusing（調製型等電点電気泳動）を用いたきなこ醗酵液の分画により得られた阻害活性画分No7（pH8.0）を濃縮し、8週齢の雄性脳卒中易発症性高血圧自然発症ラット（SHRSP）に経口投与して、投与前の血圧、投与後の経時的な血圧（0.5、1、2、4、8、24時間後）測定した。その結果、有意差が得られなかったので、10週齢で再度SHRSPに経口投与したが、これも有意差を得ることはできなかった。また、画分No6（pH4.0）の経口投与も同様の結果であった。指標としたangiotensinⅠ converting enzyme（ACE）阻害活性は、各画分で高い値が得られていた。この時、醗酵温度40℃と高く維持したため、阻害物質の生成は進んだが、効率を重視して醗酵を3～8日間と短く切り上げたため、阻害物質と想定しているきなこタンパク質からのペプチドが充分低分子化されず、SHRSPの消化酵素により別な部位でペプチド結合が切断されて、異なる構造のペプチドが生成された可能性が考えられた。
そこで、再度、40℃できなこの醗酵を行い、醗酵開始3日目、25日目、45日目、87日目で特に高いACE阻害活性が得られた。これらの醗酵液を採取し、グラファイトカーボンカラムにかけ、H2O、20％、50％、100％メタノールおよび100％アセトニトリルで溶出を行ったところ、いずれの醗酵日数のものにおいてもH2O溶出画分に高いACE阻害活性が得られ（40％以上の阻害率で、他の溶出画分は、0～20％の阻害率）、阻害物質が水溶性の高い化合物であることが示唆された。

Strategy for Future Research Activity

昨年度の研究で、醗酵日数をやや延長することで、比較的水溶性の高いACE阻害物質が得られた。醗酵液には、麹の酵素により加水分解された多様な化合物が存在しているので、再度、Autofocusingにより、ACE阻害活性の高い画分を調製して、8～10週齢の雄性SHRSPに経口投与して経時的に血圧を測定し、in vivoでの血圧降下作用を確認する。もし単独画分でin vivoでの血圧低下作用が低ければ、各画分が相乗効果を示している可能性も考えられるので、今年度は、活性画分の組み合わせでのACE阻害活性を検討する。
本阻害物質が予想通りペプチドであれば、C18カラムやイオン交換カラムなどを用いて部分精製を行い、その画分をHPLCにより精製する（in vitroでの血圧降下作用の指標は、これまで通りACE阻害活性を用いる）。その後、LC/MSなどにより、目的の生理活性物質の構造を解析する。
但し、この血圧降下作用をが複数の生理活性物質の相乗効果により発現されていると考えられる場合には、最も高いACE阻害活性を示す、または、生成量が多いと考えられる生理活性物質にターゲットを定め、その構造を解析する。そして、応用の際には、きなこ醗酵液を混合物として利用するが、解析できた物質を生理活性の関与成分として用いることとする。
目的の阻害物質を得るための醗酵期間が比較的短時間であり、上記のin vivoの結果が良ければ、NaCl低減（または不使用）の醗酵で、目的物質生成後の精製の効率化についても検討する。醗酵制御のために添加するNaCl量が低減できれば、麹菌の酵素が働きやすくなり、さらに効率的に目的物質が生成できる可能性がある。これも実用化に向けてのメリットとなる。