食経験の豊富な納豆菌を利用した食品産業用酵素開発の超高速度化

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07762
• Research Institution: Saitama Institute of Technology
• Principal Investigator: 秦田 勇二 埼玉工業大学, 工学部, 教授 (20399562)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 納豆菌 / プラスミド / 発現ベクター / 酵素

Outline of Annual Research Achievements

安全性の担保された納豆菌を生産宿主として利用した酵素高生産ツールの完成を目指す。その結果として、食品産業用酵素の開発の高速度化が期待できる。納豆菌T株より申請者が新たに発見したプラスミドDNA（pTHK）の配列・機能解析を進めた。pTHKを鋳型にしてPCRによって様々なプラスミド領域の遺伝子断片を増幅した。これらの遺伝子断片と大腸菌プラスミドベクターとを連結し、構築した各プラスミドが納豆菌で複製するかどうか詳細に調べた。それらの結果からpTHKの全領域の中で、納豆菌内でプラスミド複製に必要な領域と、複製には必須ではない領域とにグループ分けすることができた。このことから、プラスミドpTHKの自立複製必須領域がかなり限定でき、本研究の主目的である酵素高生産ツールの土台構築に向けた重要部分を明らかにできたと考えている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は納豆菌T株を宿主とした酵素高生産ツールを確立することが主目的である。納豆菌T株より申請者が新たに発見したプラスミドDNA（pTHK）を酵素高生産利用に向けて最適化することを最初のステップとして進めている。本年度の解析結果からpTHKの全領域の中で、納豆菌内でプラスミド複製に必要な領域と、複製には必須ではない領域とにグループ分けすることができた。このことから、プラスミドpTHKの自立複製必須領域がかなり限定でき、本研究の主目的である酵素高生産ツールの土台構築に向けた重要部分を明らかにできたと考えられ、おおむね順調に進展していると判断できる。

Strategy for Future Research Activity

本研究課題の研究期間内に、納豆菌T株を宿主とした酵素高生産ツールを確立する。具体的には以下の３段階で進めていく。現在は最も時間を要すると想定していた①段階の最終部分を推し進めている。
①納豆菌T株より見出されたプラスミドDNA（pTHK）の特徴解析と改良。②産業利用するために必要な遺伝子セットをpTHKプラスミド(上記１で構築したもの)に導入。③宿主としての納豆菌T株の高機能化。

Causes of Carryover

本年度はプラスミドDNA（pTHK）の納豆菌内での複製必須領域を調査した。その過程ではPCRによるDNAの試験管内増幅の工程を経ることから、PCR反応により増幅DNA内に意図していない変異が導入されていないことをその都度確認するという目的で、DNAシークエンス解析のための費用を想定していたが、DGGE電気泳動法などを取り入れることによって目立ったDNA変異がないことを確認しながらここまで進めることができた。この工夫により本年度はDNAシークエンス解析のための費用を大幅に縮小させることができており、全DNAシークエンス解析は最終プラスミド構築直前とプラスミド完成後に実施する方針とした。特に構築したベクターの物質特許出願の際には発明プラスミド毎に正確な配列記載が必要であると考えられ、次年度にDNAシークエンス解析費用が生じる。

Expenditure Plan for Carryover Budget

本年度はプラスミドDNA（pTHK）の納豆菌内での複製必須領域を調査した。次年度はその成果を踏まえて納豆菌内で利用できる発現ベクター数種を完成させる。発現時期を制御できるプラスミドや菌体内のみで発現できるプラスミド、菌体外に目的の酵素を分泌させる目的のプラスミドなど数種類のプラスミドを完成させて、特許の出願準備に入る。特許明細書の作成にあたり各プラスミド完成形の正確な配列記載のために慎重にDNA配列の確認を行う。DNAシークエンス解析は５’側から３’側とその反対方向への解析と２通り実施する。