2018 Fiscal Year Research-status Report
食経験の豊富な納豆菌を利用した食品産業用酵素開発の超高速度化
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16K07762
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| Research Institution | Saitama Institute of Technology |
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Principal Investigator |
秦田 勇二 埼玉工業大学, 工学部, 教授 (20399562)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 納豆菌 / プラスミド / ベクター / シャトルベクター / 染色体DNA相同性組換え |
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| Outline of Annual Research Achievements |
安全性の担保された納豆菌を生産宿主として利用した酵素高生産ツールを構築する。この技術を用いることで食品産業用酵素の開発の高速度化が期待できる。H28年度は納豆菌株T株より我々が新たに発見したプラスミドDNA（pTHK）の全領域の中で、納豆菌内でプラスミド複製に必要な領域と、複製には必須ではない領域とにグループ分けすることができた。この結果を基盤としてH29年度は同プラスミドの小型化を図った。検討の結果、被複製開始領域と推定できる領域が特定できたことで、元のプラスミドの大きさの約60％の大きさにまで小型化したプラスミドに取得に成功した。好ましいことに、小型化したプラスミドは元のプラスミドよりも納豆菌への導入効率が飛躍的に向上した。続いて、最小化できたプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを連結して納豆菌⇔大腸菌シャトルベクターを構築することにも成功した。これらの進捗をもとにしてH30年度は本プラスミドのさらなる応用を検討した。その一つとして納豆菌の性質を改善するためへの納豆菌染色体DNAの改変を検討した。ただし納豆菌株T株のゲノム情報は未だ明らかではないので、先ず納豆菌と分類系統的に近い枯草菌の染色体DNAの改変に本プラスミドが利用できるか試行することとした。その結果、同プラスミドをベクターとして使用した相同性組換え実験により、染色体DNA上への目的遺伝子の導入に成功した。二つ目の応用検討項目として、目的とする酵素を納豆菌で高生産させることを目指し取り組んだ。H29年度に構築できた大腸菌⇔納豆菌シャトルベクターに枯草菌由来のアミラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを構築し、これを納豆菌に導入した。その結果、SDS－PAGE解析で検出できる量の目的アミラーゼの分泌生産ができていることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規プラスミド応用検討の2項目（相同性組換え及び外来酵素遺伝子の発現）が順調に進んでいることから、全体的におおむね順調に進んでいると判断できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
抗生物質耐性遺伝子のみでなく、新規プラスミドを利用して様々な遺伝子を染色体DNA上に効率よく挿入することを試す実験を進める。一方、アミラーゼ以外の他の酵素遺伝子もシャトルベクターに乗せて納豆菌に導入し、それらの目的酵素生産能力を評価する。同時に形質転換効率の高い納豆菌への遺伝子導入法の検討も引き続き実施する。
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| Causes of Carryover |
染色体DNAの改変実験は対象微生物の形質だけでなく遺伝子レベルでの変化を慎重に確かめる必要があるため１サイクルの実験が比較的長期となる。同じ方法で様々な遺伝子を導入することや欠失させることが可能であるか試すことは大変価値ある検討であるので、次年度に延長して研究を継続することとした。同様に、アミラーゼ遺伝子だけではなく、他の目的遺伝子も効率よく納豆菌内で発現できるかどうか複数検討することは大いに有意義な検討であるので継続することとした。延長使用する予算の主な使途は、染色体DNA相同性組換え実験でのDNA配列解析、酵素遺伝子発現実験でのプラスミド（複数種類）構築のための遺伝子工学実験試薬およびDNA配列確認費用および生産できた酵素量評価のためのタンパク質電気泳動試薬などに要する物品費である。
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Research Products
(2 results)
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[Presentation] Droplet-based microfluidic screening for obtaining microbes producing macromolecule-degrading enzymes2018
Author(s)
Ryo Iizuka, Kai Saito, Eiji Shigihara, Wataru Kawakubo, Daiki Tanaka, Dong Hyun Yoon, Tetsushi Sekiguchi, Shuichi Shoji, Mei Ito, Yuji Hatada, Takashi Funatsu
Organizer
第56回日本生物物理学会年会
