2019 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of enzyme development method for food industry using Bacillus subtilis var. natto.
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16K07762
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| Research Institution | Saitama Institute of Technology |
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Principal Investigator |
秦田 勇二 埼玉工業大学, 工学部, 教授 (20399562)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 納豆菌 / プラスミド / ベクター / 遺伝子導入 / 形質転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
安全性の担保された納豆菌を生産宿主として利用した酵素高生産ツールを構築する。この技術を用いることで食品産業用酵素の開発の高速度化が期待できる。H28年度は納豆菌株T株より我々が新たに発見したプラスミドDNA（pTHK）の全領域の中で、納豆菌内でプラスミド複製に必要な領域と、複製には必須ではない領域とにグループ分けすることができた。この結果を基盤としてH29年度は同プラスミドの小型化を図った。検討の結果、被複製開始領域と推定できる領域が特定できたことで、元のプラスミドの大きさの約60％の大きさにまで小型化したプラスミドに取得に成功した。好ましいことに、小型化したプラスミドは元のプラスミドよりも納豆菌への導入効率が飛躍的に向上した。続いて、最小化できたプラスミドと大腸菌由来のプラスミドを連結して納豆菌⇔大腸菌シャトルベクターを構築することにも成功した。これらの進捗をもとにしてH30年度は本プラスミドのさらなる応用の一つとして納豆菌の性質を改善するためへの納豆菌染色体DNAの改変を検討した。その結果、同プラスミドをベクターとして使用した相同性組換え実験により、染色体DNA上への目的遺伝子の導入に成功した。令和元年度は抗生物質耐性遺伝子のみでなく、新規プラスミドを利用して様々な遺伝子を染色体DNA上に効率よく挿入することを試す実験を進めた。結果としては、抗生物質耐性遺伝子のみ染色体組換えに成功した。構築したシャトルベクターだけではなく、pHY300PLKを用いた形質転換も試みた。形質転換にはプロトプラスト法が有効であった。その結果、アミラーゼ、セルラーゼ、アガラーゼ遺伝子などの導入に成功した。興味深いことにpHY300PLKをベクターに用いると、内在プラスミドであるpTHKのコピー数が極端に低下することも明らかとなった。
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