水温に依存する魚類の生体防御機構におけるインタ－フェロンの役割

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07841
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 一色 正 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (30378319)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 水産学

Outline of Annual Research Achievements

ウイルス性出血性敗血症（VHS）に対するホルマリン不活化ワクチンを水温20℃で接種したヒラメには感染防御能が誘導される。本研究では3 つの実験を設定し，本ワクチンを投与したヒラメの各器官における免疫関連遺伝子の発現をリアルタイムPCRを用いて解析することにより，本ワクチンの作用機序にインタ－フェロン（IFN）が関与していることを確認した。
すなわち，実験1では，水温20℃でVHS ウイルスをヒラメに接種した。実験2では水温20℃でホルマリン不活化ワクチンを接種した。実験3ではホルマリン不活化ワクチンを接種後，14日間水温20℃で飼育し,その後水温12℃で攻撃接種を行った。実験1および2では，接種1, 3, 7, 14 日後に3 尾の魚から心臓,脾臓および腎臓を採取し,RNA を抽出し,逆転写をした後リアルタイムPCRに用いた.リアルタイムPCR では, IL6, TNF, IFNγ, Mx, CD8αの遺伝子の発現の変化を調べた。実験3では攻撃1, 3, 7, 14 日後に同様にして臓器を採取して解析した。
その結果，実験1では炎症性サイトカインの発現が高かった。実験2では，炎症性サイトカインの発現は低かったが，MxやCD8αの発現は実験1と同様であった。実験3でも，炎症性サイトカインの発現は抑えられていたが，Mxは非常に強い発現を示した。また，各免疫関連遺伝子の発現は心臓で強い傾向があった。さらに，実験1，実験2では心臓のMxの挙動が脾臓や腎臓とは異なっていた。これらのことから，ワクチン接種後は炎症反応が抑えられること，および本ワクチン投与法によって誘導される免疫ではⅠ型IFNが重要であることが示唆された。また，心臓が魚類の免疫に重要な役割を持っている可能性が考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

計画していた実験項目をほぼ全て実施できた。本実験により，当初に予想していたIFNの関与を指示する結果が得られただけでなく，心臓が魚類の免疫に重要な役割を持っている可能性を示唆する新規の知見も得られた。したがって，今後の研究は計画どおりに推進して問題ないものと思われることから，おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度に得られた結果に基づき，IFN産生の温度依存性およびVHSワクチンの効果に及ぼすIFNの関与について，リコンビナントIFN（rIFN）を用いて検討する。具体的にはヒラメIFNに関する遺伝子情報を基にしてプライマ－を設計し，VHSウイルスの実験感染ヒラメからIFN遺伝子を増幅後，大腸菌系によりタンパク発現誘導を行ってrIFNを作製する。このrIFNを異なる温度で飼育したヒラメに投与後，経時的に頭腎を採取して免疫関連遺伝子の発現を検出・定量するとともに，ヒラメをVHSウイルスで攻撃し，感染防御能の誘導効果を調べる。なお，rIFNの代わりにワクチンを投与したヒラメについても同様にして処理する。一方，ヒラメ由来培養細胞にrIFN，およびワクチン投与後に採取した頭腎の抽出液をそれぞれ添加後，VHSウイルスを接種し，VHSウイルス産生量を測定する実験等を行う。これらの実験によって得られた結果を取りまとめ，成果の発表を行う。