2017 Fiscal Year Research-status Report

タイプIII分泌機構に着眼した魚類エドワジエラ症原因細菌の病原機構の解明

Research Project

Project/Area Number	16K07849
Research Institution	Kagawa Prefectural College of Health Sciences
Principal Investigator	奥田潤香川県立保健医療大学, 保健医療学部, 教授 (90334276)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中井敏博広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (60164117) [Withdrawn] 末澤千草香川県立保健医療大学, 保健医療学部, 講師 (90331868) 河東康彦国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 研究員 (90634220)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	Edwardsiella tarda / ヒラメ感染実験 / タイプIII変異株 / Yeast two-hybrid法
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、E. tardaのマクロファージ内での増殖性、上皮細胞への侵入性、ゼブラフィシュへの病原性に関連しているタイプIII分泌装置遺伝子クラスター内の５つの機能未知遺伝子（escC, orf13, orf19, orf29, orf30遺伝子）に着目し、宿主細胞内で結合する宿主因子を同定することにより、未知の病原性発現機構を明らかにすることである。当該年度では、５つの機能未知遺伝子ノックアウト株の内、orf13, orf19, orf29, orf30遺伝子ノックアウト株と野生株をヒラメに腹腔内接種し、野生株投与群とノックアウト株投与群の累積死亡率に差が生じるかを経時的に調べた。その結果、orf13遺伝子ノックアウト株では病原性の著しい低下が認められ、また、orf30遺伝子ノックアウト株では病原性発現時間の遅延が認められた。また、感染魚についてから分離したマクロファージ内での野生株およびノックアウト株の増殖性を比較しているが、現在実験を行っているところである。また、orf29とorf30遺伝子配列から推定されるペプチド断片に対するウサギポリクローナル抗体の作製を完了した。 orf13, orf19, orf29, orf30遺伝子については、結合する宿主因子をタンパク質－タンパク質間の相互作用で検出するYeast two-hybrid法に用いるためのクローニングを完了した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 計画書に記載したヒラメ感染実験の遂行やYeast two-hybrid法に用いるクローンの完成等、ほぼ予定通りに進展していると思われる。
Strategy for Future Research Activity	機能未知遺伝子と結合する宿主因子をタンパク質－タンパク質間の相互作用を検出するyeast two-hybrid法で網羅的に探索する。また、ヒラメに対する感染実験では、ヒラメマクロファージ内での野生株およびノックアウト株の増殖性について検討し、データを確定させる。
Causes of Carryover	(理由) Yeast two-hybrid法に関して、比較的費用がかからないクローニングの段階までしか進めなかったことから、物品費に余剰金が生じた。（使用計画）最終年度は、Yeast two-hybrid法による宿主因子の同定とそれに引き続く機能解析が予定されている。そのために、同定された宿主因子に対する特異抗体や共焦点レーザー顕微鏡によるco-localizationの確証用の標識抗体などを購入する必要があるため、余剰金は主に物品費に使用する予定である。また、良いデータが得られれば学会発表や論文投稿にも費用を使用したい。