2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K07864
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
尾島 孝男 北海道大学, 水産科学研究院, 教授 (30160865)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 晶 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (70396307)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アワビ / アルギン酸 / DEH / KDG / 代謝酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アワビは褐藻を摂餌するが、褐藻の主要糖質であるアルギン酸を炭素栄養源としているのかどうかは未だ不明である。それは、アルギン酸の酵素分解物のα-ケト酸（4-deoxy-L-erythro-5-hexososeulose uronic acid, DEH）が動物の解糖系（Embden-Meyerhof経路）では代謝できないからである。先に申請者らは、このDEHをNADPHの存在下で2-keto-3-deoxy-D-gloconate（KDG）に変換する酵素HdRedをアワビ肝膵臓から単離しクローニングすることに成功した。これは、アワビがアルギン酸分解物のDEHを代謝可能であることを示す発見である。本研究では、HdRedの反応産物であるKDGが、次にどのような代謝を受けるかを明らかにするために、KDG変換酵素の探索と性状解析を行った。先ず、アワビの肝膵臓粗酵素をKDGに加えると、KDGの減少が起こることを確認した。ただし、その反応産物は同定できなかった。一方、アワビ肝膵臓cDNAについてトランスクリプトーム解析を行い、111,139 contigsの塩基配列を得た。そこで、古細菌や真正細菌で知られているKDGキナーゼおよびKDGアルドラーゼに類似の遺伝子があるかどうかを検索した。その結果、KDGキナーゼの遺伝子は見つからなかったがKDGアルドラーゼとアミノ酸レベルで25%程度の同一性を示す候補遺伝子が３つ見つかった（Hd18197、Hd30883、Hd34619と命名)。大腸菌によりそれらの組換えタンパク質を発現し、KDGに作用させた結果、Hd30883がKDGをグリセルアルデヒド（GA）とピルビン酸（PA）に変換する酵素活性を有することが確認された。この結果より、アワビの肝膵臓にはアルギン酸由来のαケト酸をKDGを経てPAとGAに変換する酵素系が存在すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度の研究計画は、アワビ肝膵臓中にアルギン酸由来のDEHを還元して生じたKDGに作用する酵素の存在を確認し、それを単離することであった。実際、アワビの肝膵臓アセトンパウダーから抽出した粗酵素にはKDGをなんらかの物質に変換する酵素が含まれると考えられたが、その酵素は不安定で精製するのは極めて難しかった。また、粗酵素を用いた実験ではKDGからの反応産物の分析もできなかった。そこで、肝膵臓のトランスクリプトームデータから、KDGに作用すると推定される酵素遺伝子の探索を行った。すなわち、古細菌や真正細菌で知られているKDGキナーゼ、KDPGアルドラーゼ、KDGアルドラーゼに類似の酵素遺伝子を探索した。その結果、KDGアルドラーゼ様の酵素遺伝子が３つ見出された。それらの組換え酵素を大腸菌により発現した結果、KDGをグリセルアルデヒドとピルビン酸に開裂するKDGアルドラーゼの活性を有することが確認できた。この結果は、アワビの肝膵臓中にはアルギン酸由来のαケト酸を最終的にグリセルアルデヒドとピルビン酸に変換し、TCA回路に導入する酵素系が存在することを示している。この点は、本研究の当初の推定と合致するものである。ただし、これは遺伝子での存在を確認したものであり、実際の酵素タンパク質は未だ精製できていない。この点については引き続き単離を目指して研究を続ける必要がある。それにより、遺伝子解析によって得たKDGアルドラーゼがタンパク質としても存在していることを確認できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度には、アワビの肝膵臓のトランスクリプトーム解析によりKDGアルドラーゼの発現を確認できた。今後は、この酵素のタンパク質としての存在を確認しなければならない。また、この酵素が肝膵臓の共在細菌由来のものではないか、という疑いもある。この点を明らかにするには、アワビのゲノム中にこの酵素の遺伝子が存在することをゲノムPCRなどで確認するべきであろう。また、本年度以降はアワビ以外の藻食性腹足類にもアルギン酸の代謝系が存在するかの検討を開始する。具体的には、アルギン酸リアーゼの性状が分かっているアメフラシおよびタマキビガイについて、アルギン酸由来のDEHをKDGに還元する酵素が存在するかを確認する。また、アワビ酵素の研究の進捗に合わせて、KDGアルドラーゼの存在も確認する。それらにより、藻食性腹足類には、共通してアルギン酸リアーゼ、DEH還元酵素、KDGアルドラーゼが存在し、それらにより褐藻のアルギン酸をTCA回路に導入できることを証明する。
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