海洋好圧好冷菌の新奇な好圧性リパーゼとその圧力特性をもたらす構造の解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K07870
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 石田 真巳 東京海洋大学, 学術研究院, 教授 (80223006)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡井 公彦 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (00596562)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 好圧性 / リパーゼ / 構造と性質 / 組換え体 / 遺伝子発現効率

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度の第一の目的である、Moritella sp. F3のリパーゼⅡ遺伝子のクローニングは計画通りに実施した。F3由来リパーゼⅡ遺伝子の全塩基配列を決定し、F1由来リパーゼⅡの配列と比較した結果、3か所の塩基置換が見つかり、2か所のアミノ酸置換が明らかになった（1箇所は同義置換）。また、F3リパーゼⅡ遺伝子は大腸菌で発現し、粗酵素を試料とする加圧測定の結果、Moritella sp. F3から直接精製したリパーゼⅡと同様に好圧性が認められないことが分かった。これらの結果から、好圧性のF1リパーゼⅡと非好圧性のF3リパーゼⅡの違いは上で発見された2か所のアミノ酸残基の違いに規定されるものと推定される。平成29年度は、この2か所のアミノ酸を部位指定変異によってF1酵素とF3酵素の間で置換し、酵素の構造と好圧性との相関を確認する。
平成28年度のもう一つの主な目的は、F1リパーゼⅡとF3リパーゼⅡの立体構造決定のための結晶化であり、そのために必要な組換え体での両酵素の高効率生産であった。当初、高効率生産のために使用したpLEADベクター・大腸菌を用いて酵素の生産条件を検討したが、結晶化には生産効率が不十分であった。そこで生産効率改善のために別の発現系であるpETベクターに遺伝子を組込んで生産量を分析中である。また大腸菌以外の宿主の使用も検討している。
結晶解析以外の立体構造推定法として、F1とF3のリパーゼⅡの全アミノ酸配列情報を用いてSwissModelによる分子モデリングを試みた。しかし、データベースに存在する立体構造既知のタンパク質にはリパーゼⅡと部分的な相同性が認められるものはほとんどなく、推定立体構造は得られなかった。この結果は、本研究課題のリパーゼⅡが構造上も新奇性の高い酵素であることを示唆しており、結晶解析による立体構造決定の必要性が一層明確になった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

好圧性のF1リパーゼⅡと非好圧性のF3リパーゼⅡを主な研究対象として、構造と好圧性との相関関係を解明することが本研究課題の最も重要な目的である。そのため、本研究課題において最も重視していた両酵素のアミノ酸配列の違いについて、期待した少数の違いの存在を明らかにすることができた。これによって、部位指定変異で確認する研究計画を予定通り進めることができ、この点に関しては平成28年度の目的をほぼ達成したと判断される。
次に、F1リパーゼⅡとF3リパーゼⅡの構造と性質の関係を解明するために必要な立体構造解析については、両酵素の組換え体での生産効率が結晶化に不十分だったため、平成28年度には当初計画の結晶化までは達成できなかった。従来の報告でも、Moritella由来酵素の遺伝子には組換え体での高効率生産の成功例は少なく、Moritellaの遺伝子が大腸菌で発現しにくい可能性は当初から予想されていた。これに対しては、宿主ベクター系を変更し、過去にMoritella遺伝子で高効率生産の報告もあるpETベクターや大腸菌以外の宿主に変更する等の対策を実施中である。
上のように、本研究課題には重要な成果があったが、平成28年度は学会発表等の成果報告を行わなかった。これは本研究課題に含まれる酵素や微生物の新奇性を軸とする特許出願の可能性を考慮したためであった。が、年度末近くになって、特許出願には酵素の応用例なども必要と分かり、特許出願を行わないことになった。

Strategy for Future Research Activity

今後も基本的に当初計画に従って研究を進める。今後の最重点である課題は、F1リパーゼⅡとF3リパーゼⅡの組換え体での高効率生産を達成することである。既に着手している発現ベクターや宿主の種類の変更を継続して実施し、最も生産効率が高い方法を選出する。また、平成28年度に組換え体での生産の対象としたF1およびF3のリパーゼⅡに加えて、生産効率向上も期待されるHis-tagを付加したF1およびF3リパーゼⅡも高効率生産の研究対象として作成する。高効率生産達成後の精製、結晶化、共同利用施設の利用、あるいは酵素の温度・圧力特性解析は当初計画の通りに実施する。
平成28年度に発見したF1リパーゼⅡとF3リパーゼⅡの2か所のアミノ酸配列の違いについては、部位指定変異法を用いて、アミノ酸残基をF1のものに置換したF3リパーゼⅡ、また逆に、F3のものに置換したF1リパーゼⅡを作成する。各変異型酵素を精製し、活性の圧力特性などを測定し、酵素の好圧性が2か所のアミノ酸によって規定されているか確認する。
また、当初計画にある他の実験項目として、Moritella sp. F1およびF3以外のMoritella属の他種細菌に由来するリパーゼⅡについても今後、遺伝子クローニングや酵素の特性解析を実施する。まずF1・F3で検討・選出した宿主ベクター系を用いて各種細菌のゲノムDNAからリパーゼⅡ遺伝子をクローニングする。続いて、耐圧性などの酵素の性質を測定してF1およびF3のリパーゼⅡと比較する。
学会発表や雑誌論文などによる成果報告についても、特許出願に関わる情報公開制限がなくなったので、積極的に実施する。

Causes of Carryover

当初計画では、平成28年度に酵素の結晶化およびそれに続く結晶解析を行うことになっていた。そのために必要な結晶化の試薬や結晶解析の共同利用施設使用料等が平成28年度の経費に含まれていた。しかし、結晶化に必要な酵素の生産効率が予想より少なく、生産効率の増強のための実験を先に実施することになった。そして結晶化以降の実験は次年度に実施することに変更した。酵素の結晶化や結晶解析に必要な経費の方が生産効率増強に必要な経費より高額であり、平成28年度には使用しない経費が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

上の理由で、費用がかかる結晶化および結晶解析の実験を平成28年度には実施せず、次年度に実施することになったため、そのための経費である約100万円を平成28年度に使用せず、次年度分の助成金と合わせて使用することに計画を変更した。