2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒラメエドワジエラ症の肝炎発生における肝門脈上流リンパ組織の関与
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16K07882
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
倉田 修 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (90277666)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂井 貴光 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 増養殖研究所, 主任研究員 (50416046)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 肝炎 / 脾臓 / 炎症性メディエーター / エイコサノイド / 肝門脈血 / サイトカイン / ヒラメ / Edwardsiella tarda |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.肝門脈血清成分の解析: ヒラメ（約430g）に対し、E. tarda NJB0401を用いて浸漬感染を行った（10の7乗CFU/mL、10分間、22℃）。感染後5日目に肝門脈血清を回収し、各種成分の比較解析を行った。アラキドン酸由来エイコサノイド数種（11HETE、12HETE、12oxoETE）は、昨年度解析した脾臓と同様に上昇していた。一方、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸由来生理活性脂質は感染ヒラメで低下し、アラキドン酸由来エイコサノイドと逆の変動を示した。肝門脈血清中のタンパクでは、熱ショックタンパク、エンドプラスミン、等が上昇していた。
2.脾臓および肝臓の網羅的遺伝子発現解析: 同感染後5日目の脾臓および肝臓の発現遺伝子について、次世代シークエンサーによる網羅的解析を行った。感染ヒラメの脾臓で発現上昇が見られた遺伝子には、IL-1β等の炎症性サイトカインに加え、生理活性脂質代謝酵素も含まれていた。特に、アラキドン酸からロイコトリエンB4（LTB4）の合成に関与する一連の酵素（LTA4Hおよび5-LO）遺伝子が検出された。同時期の感染ヒラメの肝臓では、LTB4レセプターおよびIL-1βレセプター遺伝子が発現上昇し、脾臓で合成された各成分に応答する状態にあることが推測できた。また、IL-8や好中球関連分子の発現上昇が確認され、肝臓の初期病変（好中球の肝臓内集簇）を裏付けた。
3.LTB4代謝関連酵素を標的とした定量PCR法の開発: 脾臓におけるLTB4の合成レベルを評価するために、代謝関連酵素であるLTA4Hおよび5-LOの定量PCR法を開発した。
4.IL-1βに対する抗体の作製: LTB4と並び、肝臓病変を引き起こすメディエーターとしてIL-1βに注目した。肝門脈血中のIL-1βの検出を目指し、ヒラメIL-1βに対する抗体の作製に取り組んだ。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
感染ヒラメの肝門脈血中には脾臓で合成されているエイコサノイドが検出され、これらのメディエーターが脾臓から肝門脈を経由し肝臓に移行していることを確認した。さらに、本年度取り組んだ肝門脈血清中の成分解析、脾臓および肝臓の網羅的遺伝子発現解析の結果から、エドワジエラ症ヒラメの肝臓病変を誘発する候補メディエーターとして、LTB4およびIL-1βを挙げることが出来た。今後の研究に活用する解析ツール（LTB4合成レベルの評価、IL-1βタンパクの検出）の開発も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. LTB4およびIL-1βによるIL-8遺伝子発現誘導能の解析: 肝臓の初期病変の特徴であるIL-8の発現が、LTB4およびIL-1βで誘導されるかどうかをin vitroの培養系で確認する。LTB4は市販の試薬を、IL-1βは大腸菌組換タンパクを使用する。感作細胞に白血球および非免疫細胞としてヒラメ鰭から樹立した細胞株（JFF07-1）を使用し、IL-8遺伝子の定量PCR法により評価する。
2. 感染後ヒラメ脾臓におけるLTB4およびIL-1βの量的変動と肝臓病変の相関について: E. tarda感染後、脾臓におけるLTB4およびIL-1βの発現変動を定量PCR（LTB4関連酵素遺伝子）およびELISA（市販のLTB4 ELISAキット、抗ヒラメIL-1β抗体の活用）により解析する。同時に、肝臓におけるIL-8遺伝子の発現、好中球の浸潤・集簇、そして構成タンパクのリン酸化修飾を調べ、脾臓での各メディエーターの量的変動と肝臓病変の進行との関連を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
ヒラメIL-1βの抗体作製は平成29年度から平成30年度にかけて取り組んでいる。そのため、作製費用（66,000円）の一部を平成30年度に持ち越した。
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