2016 Fiscal Year Research-status Report
ウシ凍結前精子の耐凍能判定法の確立を目的としたSPACA1タンパク質の解析と利用
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16K07990
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
原山 洋 神戸大学, 農学研究科, 教授 (30281140)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中嶋 昭雄 神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 助教 (70397818)
坂瀬 充洋 兵庫県立農林水産技術総合センター, 北部農業技術センター, 上席・主任研究員 (70463396)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 応用動物 / 畜産学 / 雄性繁殖能力 / 精子 / 人工授精 / ウシ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
・（実験1）サンプルの準備と性状検査：ウシ（黒毛和種）12頭から新鮮射出精子（36サンプル）を採取した。精子の一般性状（前進率，奇形率，正常先体率）を調べ，サンプル毎に成績を記録した。また一部のサンプルを用いて体内受精試験に使用する精子を凍結保存した。また廃用となった雄個体から精巣を採取し，実験3で使用した。
・（実験2）先体耐凍能判定法の精度向上に関する取り組み：実験１で採取した射出精子を洗浄後に様々な濃度の炭酸水素ナトリウムを含む培養液に浮遊させ，運動精子の顕微鏡像動画をハイスピードカメラ記録システム（購入備品）で録画した。得られた動画をコマ送り再生して前進率，前進速度および鞭毛屈曲の対称性を解析し，精子鞭毛機能の検査に好適な炭酸水素ナトリウム濃度（20 mM）を明らかにした。また炭酸水素ナトリウムの添加効果には細胞内cAMPシグナル伝達機構の活性化が関与することを示唆した。他方，先体耐凍能を制御する責任タンパク質を免疫二重染色法および免疫沈降ウェスタンブロッティング法により先体主部に分布するSPACA1タンパク質に絞り込むことに成功した。専門業者への委託によりウシ精子に対してより高い特異性を示す抗SPACA1抗体の作製を試みたが，得られた抗体は市販抗体を使用した場合と異なる染色パターンを示したことから，現在はこの抗体の反応特性を検討している。
・（実験3）先体耐凍能判定法の原理解明に関する取り組み：実験1で採取したウシ精巣に由来するmRNAからRT-PCR法により増幅したcDNAを用いて培養体細胞にGFP標識SPACA1タンパク質を発現させた。その結果，SPACA１タンパク質は培養体細胞の細胞質内では顆粒状に存在し，さらにその一部は細胞膜に分布する傾向が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
兵庫県立農林水産技術総合センター・北部技術センターとの緊密な連携により，当初の予定通りの数のサンプルを対象とした一般性状検査を完了し，凍結精子を作製し，さらに精巣も入手できた。これらのことから，実験1の目標は十分に達成されたといえる。実験2においても精子鞭毛機能の検査法開発に関する有意義な成果が得られ，先体耐凍能を制御する責任タンパク質も順調に絞り込むことができた。また実験3では先体耐凍能判定法の原理解明に使用する組換え培養体細胞の作製技術を構築できたことから，目標を達成できたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度の目標を概ね順調に達成できたので，引き続き下記の研究課題を遂行する。但し，より高い特異性を示す抗SPACA1抗体の作製については，市販抗体の使用時と比較しながら再検討する。
（実験1）「サンプルの準備と性状検査」の継続
（実験2）「先体耐凍能判定法の精度向上に関する取り組み」の未解決課題の継続
（実験3）「先体耐凍能判定法の原理解明に関する取り組み」 の新規課題の遂行：組換えウシSPACA1タンパク質発現体細胞を材料とし，細胞膜の特性解析，特に脂質ラフトでのSPACA1タンパク質の動態解析を，ウェスタンブロット法，免疫共沈降法などにより明らかにする。また同様の解析をウシ精子にも行い，精子内でのSPACA1タンパク質の動態や機能を究明する。
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