2017 Fiscal Year Research-status Report
ブタ卵の体外成熟に伴う透明帯の硫酸化修飾に起因した多精子受精抑制技術の確立
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16K07992
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
建本 秀樹 琉球大学, 農学部, 教授 (70227114)
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2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ブタ体外受精 / 透明帯 / 糖タンパク質 / dextran sulfate / 多精子受精 / 先体反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ブタ卵の体外受精(IVF)時に高頻度で起こる多精子受精は，ブタの繁殖技術の発展を妨げる原因の一つである。これまでの我々の研究で，成熟に伴ってブタ卵では透明帯構成糖タンパク質の硫酸化が起こっていることが確認され，この硫酸化が透明帯に結合した精子のプロアクロシン活性化により惹起される先体反応の誘起に伴った精子と透明帯との二次結合に影響を及ぼしている。そして，平成28年度の研究結果では，ブタ透明帯構成糖タンパク質の硫酸化残基と精子との結合が受精時の精子－透明帯間の相互作用に重要であることをsulfatase処理を用いて証明した。そこで，本年度の研究では透明帯硫酸化残基に結合する精子arylsulfatase A (ARSA)に着目し，ARSAを介してブタIVF時の多精子受精を抑制できるか否かを検討した。
本研究には，卵巣から採取した卵丘細胞卵子複合体(COCs)を体外成熟培養して用いた。その後，透明帯硫酸化糖鎖へのARSAの結合を阻害するdextran sulfate (DS)を添加した培地で裸化卵によるIVFを行い受精パラメーターを調べた。さらに媒精2時間後には，透明帯への結合精子数と透明帯結合精子の先体反応誘起率を測定した。その結果，50 ng/ml DSのIVF培地への添加によって75%以上の精子侵入率を維持した状態で多精子受精率(3%)のみが対照区(30%)に比べて有意に減少した。また，DS処理区の透明帯結合精子数および精子先体反応誘起率は，無処理区と比較して有意に減少し，ARSAが精子－透明帯間の相互作用に伴った精子の先体反応と第二次結合に関与していると推察された。
以上の結果から，ブタIVF時におけるDSの至適濃度によるARSAの透明帯硫酸化糖鎖への結合阻害は，精子侵入率を維持したまま高頻度に起こる多精子受精を効果的に抑制することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ブタに対して繁殖工学技術を有効に活用する上において，大きな妨げの1つとしてIVF時に高頻度に起こる多精子受精が挙げられる。特に，ブタは他の動物種に比べてIVF時の多精子受精が高率である（Hao et al., 2006）。したがって，研究環境の違いによる影響を極力抑えつつ多精子受精を効果的に抑制する新しいIVF法を確立することは非常に重要である。
これまでの我々の研究により，ブタ卵の場合，卵成熟に伴って透明帯構成糖タンパク質が硫酸化することが明らかとなった(Lay et al., 2011)。そこで受精時における精子―透明帯間の精子二次結合に関わる透明帯構成糖タンパク質の硫酸化に着目した。まず，透明帯構成糖タンパク質の硫酸化が高頻度に起こる多精子受精に関与しているか否かを確認する目的で，IVF時に卵をsulfataseで前処理し透明帯構成糖タンパク質の脱硫酸化を行った。その結果，sulfataseによる脱硫酸化処理は胚発生能に悪影響を及ぼさずに多精子受精を効果的に抑制した。次に，精子arylsulfatase A (ARSA)と透明帯構成糖タンパク質の硫酸化残基との結合に着目し，IVF時に50 ng/ml dextran sulfate (DS)でARSAと透明帯硫酸化糖鎖残基との結合を阻害したところ，受精パラメーターの内，多精子受精率のみが顕著に低下し，正常胚作出にDSを添加したIVF法は有効であった。
すなわち，多精子受精を効果的に抑制するIVF法を確立する上において，透明帯の硫酸化糖鎖を介した精子―透明帯間の相互作用に着目することが有意義であり，その重要性が卵透明帯構成糖タンパク質の硫酸化残基と精子ARSAの両面からの研究で証明された。したがって，本研究を遂行するに当たって，研究は順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度の結果から，透明帯の硫酸化糖鎖は精子先体部の細胞膜表面に存在するarylsulfatase A (ARSA)と結合し先体反応誘起に関与していることが明らかとなった。しかも，この透明帯硫酸化糖鎖へのARSAの結合を阻害すると，多精子受精を効果的に抑制する事が可能であると云った新たな知見が得られた。そこで，今後の研究では，ARSA blocking peptideを使用し，直接，精子ARSAの透明帯硫酸化糖鎖への結合作用を阻害し，ARSAと透明帯硫酸化糖鎖の相互作用が多精子受精に影響を及ぼしていることを明確に証明する。さらに，DSやARSA処理が透明帯硬化や透明帯反応誘起と云った別の作用機序を介してブタ卵の多精子受精抑制を引き起こしている可能性も考えられる。そこで，DSやARSAで処理した卵透明帯の卵活性化に伴う変化をレクチンブロッティング法で検証する。
本実験にはブタ卵巣の小卵胞(直径2-6 mm)から切開法で採取した卵丘細胞卵子複合体(COCs)を用いる。44時間の体外成熟培養(IVM)を行ったCOCsの卵丘細胞を除去し，裸化卵の一部を様々な濃度のARSA blocking peptideを添加した培地でIVFを行い受精パラメーター，透明帯結合精子数，および透明帯に結合した精子の先体反応誘起率を調べる。次に，ARSAやDSで処理した裸化卵に直流電気パルスによる活性化処理を行い，これら卵から透明帯を時間経過に応じて分離し透明帯構成糖タンパク質にビオチン標識を行いECL法で解析し，卵活性化に伴う透明帯構成糖タンパク質の変化にARSAやDSが影響を及ぼしているか否かを明らかにする。
そこで今後の研究では，精子ARSAと透明帯構成糖タンパク質の硫酸化残基との関係に着目した多精子受精を効果的に抑制する新しいIVF法の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
次年度の研究では，微量なブタ透明帯構成糖タンパク質の変化を検出する為に，レクチンブロッティング法を介した高感度なECL法を用いる必要がある。そこで，次年度は，レクチンブロッティング法とECL法に関わる高価な試薬類の購入を主な研究費の使用用途として計画している。
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