2016 Fiscal Year Research-status Report
ウシ精子の体外受精胚発生率および受胎性に係るDNAメチル化状態の解明
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16K07999
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
武田 久美子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門 家畜育種繁殖研究領域, 上級研究員 (60414695)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 栄治 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門 家畜育種繁殖研究領域, ユニット長 (00186727)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ウシ / 精子 / メチル化 / マイクロアレイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、４検体の体外受精後の胚発生率や人工授精後の受胎率の異なるウシ精子核DNA メチル化状態を比較解析し、メチル化可変部位 の検出を行うことが目的である。
まず、体外受精後の胚発生率の異なる４頭の雄牛(胚盤胞形成率20%以上 vs. 10%未満)についてHumanMethylation450 BeadChip(HM450)による比較解析からメチル化可変部位を94箇所抽出した。ウシゲノム配列に対するBLAST検索によりヒト-ウシ間の塩基配列の相同性を確認したところ、63箇所のCpG部位のウシ配列が特定できた。そのうち制限酵素切断認識部位にCpG部位のメチル化が関わるものは12箇所であり、COBRA法による検証を行ったところ、4箇所のCpG部位について差異が検出できた(Takeda et al.,2017)。しかしながら、その他の体外受精胚発生率の異なる凍結精液サンプルのメチル化度をCOBRAで解析した結果、体外受精後の胚発生率との関連は認められなかった。
本年度、より高密度な解析が可能となった改良型ヒト高密度メチル化解析用チップ（EPIC, Infinium MethylationEPIC BeadChip,イルミナ社）がHM450に代わって市販されたことから、人工授精後の受胎率の異なる雄牛６頭(55％以上 vs. 40%未満)の凍結精液について、EPICによる解析を行った。EPICに搭載された85万箇所のCpG部位のうち96,466箇所について信頼性の指標であるDetection P-val値および総蛍光強度により解析に有効と判断できた。それらCpG部位についてグループ間の比較解析を行い、メチル化可変部位を抽出、リストアップした。リストアップした349箇所のメチル化可変部位についてBLAST検索を行ったところ57箇所のCpG部位のウシ配列が特定できた
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
改良型ヒト高密度メチル化解析用チップ（Infinium MethylationEPIC BeadChip,イルミナ社）を用いた解析データを、従来のHumanMethylation450 BeadChipによる解析データと比較した結果、チップのバージョンや外注業者などにより値が変動することが判明した。従って、HM450のデータにEPICのデータを追加する場合には注意が必要である。また、ウシゲノムに対して約4万箇所のCpG部位が解析に有効とされたHM450と比較して、EPICはおおよそ2倍の約9.6万箇所のCpG部位が解析に有効とされ、より密度の高い解析が可能であることが示された。そこで本研究においては以後の解析を新バージョンのEPICのデータのみで比較することとした。EPICによる解析結果から受胎性の違いで差のみられたCpG部位が多数みつかっており、おおむね順調に進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度得られた結果よりメチル化差異の簡易検出のためのCOBRA法で検出できる系を確立し、より多数の検体のスクリーニングを行うと共に、これらの差異が体外受精胚へどのように影響するかを調査する。一方で、人工授精後の受胎率の異なる凍結精液サンプルとして新たに４検体をヒト高密度メチル化解析用チップ（Infinium MethylationEPIC BeadChip,イルミナ社）で解析し、網羅的なメチル化状態について地域性の相違も含めた検証を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
解析予定としていたメチル化チップがメーカーの都合により改良型での分析となった。そこで実験補助員を雇用予定としていたが雇用せず、改良型メチル化チップの解析依頼の検体数を増やすことを優先したため、結果的に残額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
昨年度の結果を検証し、改良型メチル化チップの解析を必要数行う。また、必要に応じて実験補助員を雇用する予定である。
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