2016 Fiscal Year Research-status Report
ウエルシュ菌産生壊死毒素（NetB）による鶏壊死性腸炎発症メカニズムの解明
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16K08026
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
向本 雅郁 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (80231629)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | ウエルシュ菌 / NetB / 鶏壊死性腸炎 / 孔形成毒素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．NetB受容体の特定
NetBに対する唯一の感受性細胞であるニワトリ肝癌由来LMH細胞をマウスに免疫し、抗LMH細胞抗体を作製した。免疫蛍光染色により抗LMH細胞はLMH細胞膜との強い結合が確認されたが、非感受性細胞であるイヌ由来MDCK細胞およびサル由来Vero細胞に対する反応は確認されなかった。さらに、抗LMH細胞抗体はNetBのLMH細胞に対する細胞致死活性を有意に阻害した。以上の結果からNetBの毒素活性における種特異性は細胞への結合能に関連しており、ニワトリにおいて特異的に発現している細胞膜上の分子が受容体である可能性が示唆された。NetBに対する受容体を特定するためにNetBと反応させたLMH細胞を可溶化後、抗NetB抗体で免疫沈降した。可溶化分画を二次元電気泳動により展開後、銀染色しNetBと反応させていないLMH細胞の免疫沈降パターンと出現したスポットを比較した。複数のスポットがNetBと反応した場合にのみ検出された。そのスポットについて液体クロマトグラフ質量分析計（LC-MS)を用いて解析し、分子の特定を試みた。解析データをデータベースと照合した結果、該当する分子は特定されなかった。
２．オリゴマー形成から細胞致死に関わる細胞側分子の役割
NetBの結合やオリゴマー形成への細胞膜上のコレステロールの関与を解析するため、LMH細胞をメチル－β－シクロデキストリンで処理し、細胞膜上のコレステロールを除去した。Triton X-114で可溶化し、ショ糖密度勾配超遠心にて分画後、抗NetB抗体を用いてイムノブロッティングを行った。その結果、NetBのモノマー分子とオリゴマー分子は同一画分に存在していた。結果、細胞膜上のコレステロールはNetBのオリゴマー形成には関与しないことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ほ乳類由来細胞株に対してNetBの結合が確認されなかったことは、NetBの細胞致死活性や赤血球溶血活性でみられる結果と一致した。したがって、NetBの毒素活性が有する鳥類に限定した高い種特異性は細胞に結合する際の受容体分子に依存していることが明らかとなった。NetBと結合するLMH細胞上の分子は免疫沈降と二次元電気泳動により数種類の分子まで絞り込むことができたが、LC/MS解析では明らかにすることができなかった。この理由として、LC/MSのデータベースにおいて登録されている鳥類（ニワトリ）由来分子はヒトやマウスなどの実験動物由来分子に比べてかなり少ないのが現状であり、今回の解析結果がデータベース上に登録されていない分子のものである可能性が考えられる。
孔形成毒素の中にはコレステロールを受容体とするものやコレステロールと相互作用してラフト領域でオリゴマーを形成する毒素が多数存在する。今回の研究において、NetBはコレステロールの関与なしに細胞に結合し、さらに非ラフト領域でオリゴマーを形成した。これらの結果からNetBは標的細胞への結合からオリゴマー形成までの一連の分子動態を細胞膜のコレステロールの関与なしに、一貫して非ラフト領域でたどることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．NetB受容体の特定
受容体にの特定については昨年度実施したLC/MSを使った解析ではデーターベースに依存することから、解析方法を変更して実施する。これまでの結果からLMH細胞をマウスに免疫して得られた抗体がNetBの細胞への結合を阻害することが示された。このことは今回用いた抗体中には受容体さらにはNetBの細胞への結合に関与する領域を認識する抗体が含まれていることを示している。そこで、今年度はLMH細胞あるいは細胞膜を抗原としてマウスモノクローナル抗体を作製する。免疫蛍光抗体法および毒素中和試験によりスクリーニングすることで、NetBの細胞への結合および毒素活性を中和するモノクローナル抗体を選別する。得られたモノクローナル抗体と反応するLMH細胞上の分子を免疫沈降および二次元電気泳動で単離し、ペプチドシーケンスによりアミノ基側5残基のアミノ酸を解読する。ニワトリの全ゲノム配列は明らかになっていることから、ゲノム情報のデータベースより5残基のアミノ酸と一致する配列を保有する分子を特定する。遺伝子組換えによりそのタンパク質を発現させ、NetBとの結合を確認する。
２．オリゴマー形成から細胞致死に関わる細胞側分子の役割
細胞膜上にはコレステロールと同様セラミドも構成成分として多数存在している。セラミドはスフィンゴミエリンの代謝亢進によって細胞膜に蓄積する脂質である。スフィンゴミエリンの代謝つまりセラミドの蓄積に関与する細胞膜のスフィンゴミエリナーゼに着目し、スフィンゴミエリナーゼ阻害剤であるGW4869を用いてセラミドへのNetBの結合およびオリゴマー形成へのセラミドの関与について明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
解析機器（LC/MS)の使用料の請求が次年度になったことと、酵素や抗体の追加購入が生じなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
解析機器の使用料が発生する。今年度は在庫分の酵素や抗体を使用したため、次年度購入する。
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