アフリカトリパノソーマ原虫メタサイクロジェネシスの分子機構の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08030
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 櫻井 達也 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (60547777)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 細胞分化 / プロテオーム解析

Outline of Annual Research Achievements

アフリカトリパノソーマ原虫は、宿主（哺乳類）とベクター（昆虫）という全く異なる寄生環境に適応するために、細胞分化を伴う複雑な生活環（ライフサイクル）を有している。宿主血流中に寄生した血流型は吸血時にツエツエバエに摂取されると、中腸内でプロサイクリック型へと分化し、宿主への感染性を失う。プロサイクリック型は、ツエツエバエ体内を移行し、口吻・唾液腺内ステージであるエピマスティゴート型へと分化し、ツエツエバエ組織に強く接着して増殖する。エピマスティゴート型はメタサイクリック型へと分化（メタサイクロジェネシス）することで、宿主への感染能を再獲得する。そして、メタサイクリック型が、ツエツエバエの吸血時に唾液とともに新たな宿主へと伝播され、その体内で血流型に分化する。一連の細胞分化は原虫の伝播に必須の生物現象であり、新規アフリカトリパノソーマ症制御法を開発する上で有望な標的となりうる。
本研究の目的は、全発育ステージの培養と、各ステージ間の細胞分化の再現をin vitroで可能なTrypanosoma congolenseを用いて、原虫の細胞分化、特に宿主感染能を再獲得するステップとして重要なメタサイクロジェネシスに関わる原虫蛋白質を探索し、その分子メカニズムを解明することである。しかし、いずれの細胞分化の分子メカニズムも未解明であり、細胞分化に関与する原虫蛋白質も未同定である。そこで本年度は、原虫の細胞分化に関与する蛋白質の手がかりを得るべく、最も高効率に再現可能なメタサイクリック型から血流型への細胞分化を誘導し、経時的に虫体を回収した後に、LC-MS/MSによるショットガン解析に供した。検出された約2,700種の蛋白質について、その量的・質的な変動に関する情報を得た。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画では、当該年度は、アフリカトリパノソーマ原虫の細胞分化に関与する遺伝子の候補をトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）により探索するとともに、それらの遺伝子のクローニングと分子性状（局在や発現パターン等）の解析までを実施する予定であった。しかし、一般にアフリカトリパノソーマ原虫の遺伝子はポリシストロニックに転写されており、原虫蛋白質の発現は転写後制御を受けることから、蛋白質レベルでの解析が有効と考えられた。そこで、当初計画していたトランスクリプトーム解析（RNA-Seq）をプロテオーム解析へと変更したこと等にともない、解析を委託する業者の選定や試料の調製法の条件検討等に時間を要し、当初予定していた細胞分化に関与する遺伝子・蛋白質の候補の絞り込みと、それらの分子性状の解析の実施にまで至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

本年度実施したプロテオーム解析の結果を基に、解析ソフトウェア（Scaffold）を用いて分化誘導に伴い発現量に変動があった原虫蛋白質のリストを作成する。また、各発育ステージで発現する蛋白質のリストを作成する。分化過程で発現の減少(または増加)が認められた蛋白質をアミノ酸配列から予想される機能・局在毎に分別する。その中から、本研究では、特にシグナル伝達に関係することが予想される蛋白質を細胞分化に関連するシグナル分子の候補とし、優先的に機能解析の対象とする予定である。以上の結果をもとに、細胞分化に関連する候補蛋白質について、それぞれ詳細な性状解析（局在解析や発現パターン解析等）を実施する。候補遺伝子のcDNAをクローニングし、大腸菌発現系を用いて組換え蛋白質として発現し、精製する。これを実験動物（マウス）に免疫し、ポリクローナル抗体を作製する。得られた抗体を用いた間接蛍光抗体法により、候補蛋白質の局在を解析する。また、ノーザンブロット法およびウエスタンブロット法により、候補蛋白質の発現パターンを転写レベル、翻訳レベルで解析する。候補遺伝子のコピー数はゲノムデータベースの情報またはサザンブロット法による解析を基に決定する。最終的に、候補遺伝子が細胞分化に関与するか否かを、逆遺伝学手法による遺伝子機能解析法や阻害剤等を用いて検証する。

Causes of Carryover

本年度内に実施予定であった細胞分化関連候補蛋白質の局在解析や発現パターン解析などの分子性状解析が実施できず、これらの実験や解析のために計上していた分子生物学実験用試薬等の購入に係る予算の一部を執行しなかったため、次年度使用額が生じた。当初の予定より遅れているものの、次年度の研究計画自体に大きな変更はない。プロテオーム解析の結果をもとに細胞分化に関与する原虫蛋白質の候補を探索し、その分子性状解析を実施する。当該助成金は、そのために必要となる分子生物学的実験用試薬等の購入に係る予算として執行する予定である。その後、細胞分化に関与する蛋白質の候補をさらに絞り込み、翌年度分として請求した助成金を用いてその生物機能解析を実施し、本研究課題全体の円滑な遂行に努める。