ネオスポラ症をモデルとした経口投与型藻類クラミドモナスワクチンの作出

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08033
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 池 和憲 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50159597)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: Neospora caninum / ワクチン / 経口投与

Outline of Annual Research Achievements

ネオスポラ症は、細胞内寄生原虫Neospora caninum感染に起因する疾患で、牛では母牛における死・流産および先天感染新生牛の神経・筋疾患、犬では幼犬の後駆麻痺を主徴とする進行性の神経・筋疾患である。本症伝播で問題となるのは、①非妊娠時の原虫感染による宿主体内での増殖と分布（タキゾイトによる水平感染）、とそれに続く②妊娠時の原虫感染あるいは妊娠等の刺激が誘因となるシスト内原虫（ブラディゾイト）の再活性による垂直感染である。以前の研究で①水平感染に対してはTh1型免疫が、②垂直感染に対してはTh2型が有効であることを明らかにし、①に対してはTh1型アジュバントを用いた注射型ワクチンが、②に対しては藻類経口投与型試作ワクチンに誘導されたTh2型免疫が効果的であることを明らかにし、経口投与型の藻類ワクチンの可能性を見いだした。
本研究の目的は、クラミドモナスを用いた藻類ワクチンの（a）粘膜アジュバントおよび発現抗原遺伝子のコドンの最適化、（b）宿主藻類培養条件による蛋白発現の最適化、そして（c）経口投与型ワクチンとしての局所免疫および全身免疫誘導におけるワクチンプログラムの最適化、をすることで更なるネオスポラ症に対する効果的かつコストパフォーマンスに優れたワクチン開発の道を開き、他の感染症への応用性も明示することである。
本年度の研究はその経口投与型ワクチンとしての、1. 大腸菌由来易熱性毒素（LT-B）アジュバントの構築、2. ワクチン用原虫抗原の遺伝子クローニング、3. 遺伝子の形質転換クラミドモナスの培養条件の検討、4. 新規クラミドモナスの分離、を行った。以下にその詳細について報告する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.大腸菌由来易熱性毒素（LT-B）アジュバントの構築：毒素原性大腸菌の易熱性毒素の塩基配列をクラミドモナスでの発現させるために、“かずさDNA研究所”のホームページ（www.kazusa.or.jp）を利用して設計し、コドンの最適化を行った。さらにその配列を基に人工遺伝子（ファスマック）を作製した。本遺伝子を“クラミドモナス－大腸菌シャトルベクター”であるpChlamy_4（Invitrogen）へ挿入組換えを行った。さらに発現蛋白の付着性を確認するために蛍光遺伝子であるGFP遺伝子をも組換え挿入した。さらにこのプラスミドをChlamydomonas reinhardtii 137c株（Invitrogen）へ、Gene Pulser II（Bio-Rad）を用いて500V, 50μF, 800Ωの条件下で遺伝子導入を行い、形質転換を行った。導入遺伝子体の選択は抗生物質であるZeocinを含むTAP寒天培地にて10～14日、26℃での培養で行った。
2.ワクチン用原虫抗原の遺伝子クローニング：ワクチン用抗原としてはタキゾイト表面由来NcSAG1およびブラディゾイト由来抗原NcBAG1の遺伝子をクラミドモナスのためのコドンの最適化を行い、さらに上記と同様の処理を行うことによって、クラミドモナスで形質転換を行った。
3.遺伝子の形質転換クラミドモナスの培養条件の検討：形質転換クラミドモナスの培養は植物インキュベーターにて5リットルスケールまで行った。しかし培養スケールが大きくなるほど培養濃度が低下する傾向が認められた。
4.クラミドモナスの分離：新規野外からのクラミドモナスの分離を行った。埼玉県内の遊水池や溜池を中心にサンプリングを行い、その後研究室にて寒天培地上で単コロニーを形成したクラミドモナス類の藻類を採取した。現在野外株として7株を－152℃にて保存している。

Strategy for Future Research Activity

1.遺伝子の形質転換クラミドモナスの培養条件の検討：形質転換したクラミドモナスの培養について、2つの方向性が必要となる。1点目はスケールアップした条件で培養効率をどのように上げて行くかである。これには培養温度、光度、溶存酸素量、溶存炭酸ガス量、培養攪拌速度等の検討が必要である。2点目は抗原の発現性を重視した方向性である。2点目については発現用ベクター、コドンの最適化との兼ね合いが重要となる。
2.ワクチンとしての剤型の検討：形質転換クラミドモナスにおける経口投与型ワクチンの剤型の検証が必要となる。すなわち、培養状態のままの液状ワクチンが良いのか、あるいは凍結乾燥ワクチンが良いのかを検討する必要がある。
3.野外分離株を用いた組換え体の作製：野外分離株については現状では凍結保存の状態である。平成29年度からは野外分離株の収集と同時に、薬剤感受性等を調べ、遺伝子ベクターとの相性が良い株について上記構築ベクターをエレクトロポレーションにて形質転換し、現状の標準株との蛋白発現量の比較検討を行う予定である。
4.経口投与型ワクチンとしての簡易評価：クラミドモナスにおける標準株ならびに野外分離株の形質導入体における経口投与型ワクチンとしての評価を行う。それぞれの剤型でワクチンをマウス経口投与によって抗体産生性を評価し、ならびに攻撃感染による防御能の評価も行う予定である。