2018 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive analyses of protein interactors of disease associated prion protein
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16K08038
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
岩丸 祥史 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 動物衛生研究部門, ユニット長 (20355142)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | プリオン / GT1-7細胞 / FITC / EMARS / 蛋白質 / 標識 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プリオン病は、宿主に発現する正常プリオン蛋白質（PrPC）が異常プリオン蛋白質（PrPSc）に構造変換され、中枢神経系に蓄積することで起こる致死性の神経変性疾患である。本研究では細胞膜上でPrPSc と共局在する分子を同定し、PrPCが構造変換を起こす分子機構の解明することを目的とする。分子群の検索は、PrPSc特異免疫細胞化学とEMARS (enzyme-mediated activation of radical sources)法を組み合わせて行う。
昨年度までに、EMARS法の最適化を行った。先行論文で報告された8B4抗体によるPrPSc特異免疫細胞化学の再現性が取れなかったため、当該研究室で作出した8D5抗体に変更した。その結果プリオン感染GT1-7細胞表面上に集積した、短い繊維状PrPScを効率的に検出可能となった。8D5抗体は、非感染GT1-7細胞上のPrPCも検出したが、両者の染色像は大きく異なっていた。
最終年度は8D5抗体による免疫細胞化学法とtyramide化合物を使用する次世代EMARS法を組合せ、プリオン蛋白質に共局在する蛋白質をFITC標識した。免疫沈降法でFITC標識蛋白を濃縮後、感染/非感染GT1-7細胞間でウエスタンブロットのプロファイルを比較した。すると感染GT1-7細胞において、質量50, 57, 75 KDaの蛋白質が高効率に標識された。液体クロマトグラフィー(LC)とタンデム質量分析(MS/MS)を連結したLC-MS/MSを用い、これらの蛋白質の同定と同時に、ペプチド断片のイオン検出強度を基にし、感染/非感染細胞間で量的相違を比較した。しかし、明瞭な量的相違が認められる蛋白は同定されなかった。今後、感染/非感染GT1-7細胞由来の検体を、2次元電気泳動を用いて展開し、そのプロファイルを比較し、LC-MS/MSで同定する。
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