ウイルス感染細胞特異的ドラッグデリバリーシステムによる狂犬病治療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08042
• Research Institution: National Institute of Infectious Diseases
• Principal Investigator: 加来 義浩 国立感染症研究所, 獣医科学部, 主任研究官 (70392321)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 狂犬病ウイルス / scFv / intrabody / ナノ粒子 / ピンポイントDDS

Outline of Annual Research Achievements

狂犬病は、狂犬病ウイルス（Rabies virus: RV）を原因とする人獣共通感染症である。ひとたび発症すると確実な治療法はなく、致死率はほぼ100%である。本研究は、RVに対する人工小型抗体（single chain variable fragment: scFv）をRV感染細胞に導入して、RVの増殖を阻害することにより、狂犬病の治療法への応用を目指す。これまでに中枢神経系を標的にしたドラッグデリバリーシステム（DDS）については研究が進められてきたが、ウイルス感染細胞特異的なデリバリーについては報告されていない。本研究では、人工小型抗体を中枢神経系のRV感染細胞特異的に発現させるピンポイントDDSの構築を行い、ウイルス増殖阻害効果について検討する。今年度には以下の項目に関して研究を行った。
1)RABV感染細胞に特異的に発現する蛋白質の探索
ピンポイントDDSの標的分子となる、感染細胞に特異的に発現する蛋白質を探索するため、過去に実施したRV固定毒株接種／非接種マウス脳のマイクロアレイ解析の結果を再検証した。その結果、接種マウス脳において、非接種マウス脳より発現が向上している遺伝子は複数確認できたものの、接種マウス脳のみに発現している宿主遺伝子は確認できなかった。このため、宿主蛋白質ではなく、RV感染により細胞表面に特異的に発現するRV-G蛋白質を標的としたピンポイントDDSの可能性を検証することにした。
2)RV-G蛋白質発現バキュロウイルスの作製
RV-G蛋白質に対するscFvを、各種抗RV-scFv遺伝子を封入したナノ粒子表面に外套させることにより、RV感染細胞へのピンポイントDDSの構築を目指した。まず抗RV-G scFvの選択に必要となる精製RV-G蛋白質を大量に作製するため、RV-G（固定毒株由来、街上毒株由来）発現バキュロウイルスを作製し、RVの発現を確認した。現在、精製RV-GをscFvファージディスプレイライブラリーのパンニングに利用するための準備を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

「１）RV 感染細胞に特異的に発現する蛋白質の探索」については、当初の計画では新たにマウスへのウイルス接種試験を行い、プロテオーム解析を実施する予定であった。しかし、過去に実施したRV接種／非接種マウス脳のマイクロアレイ解析結果の再検証を行うとともに、他グループの論文報告のデータも複数検証したところ、RV感染細胞・組織のみに発現している宿主遺伝子／蛋白質を確認できなかったことから、現時点で新たに動物実験およびプロテオーム解析を実施しても得られる成果は少ないと判断した。そこで、確実にRV感染細胞のみに発現しているウイルス由来蛋白質に着目した。RV-G蛋白質は、固定毒株感染細胞の細胞膜上にはが顕著に発現しており、街上毒株感染細胞の細胞膜上にも低レベルながら発現することが知られていることから、RV-GをピンポイントDDSの標的として、今後の研究を進めることとした。これらのことから、本項目についてはおおむね計画通りに進行したと考えている。
「２）RV-G蛋白質発現バキュロウイルスの作製」については、RV固定毒株および街上毒株のG蛋白質を発現するバキュロウイルスを作製し、発現を確認することができた。今後の抗RV-G scFvを選択するためのツールができたことから、本項目についてはおおむね計画通りに進行したと考えている。

Strategy for Future Research Activity

本年度に作製したRV-Gタンパク質発現バキュロウイルスを用いて、精製RV-Gを調製する。これを固相化抗原として用いて、scFvファージディスプレイライブリーのパンニングを行い、抗RV-G scFvクローンを複数選択する。これらのクローンをナノ粒子あるいはウイルスベクターの表面に外套させ、RV感染細胞特異的な吸着およびエントリーが可能かどうかを検証する。
一方、導入する各種抗RV蛋白質scFvについては、市販試薬を用いたscFv発現プラスミドのtransfectionでは、クローンごとに導入／発現効率に顕著な差があったため、ウイルス増殖阻害効果を十分に比較検証できなかった。そこで、各scFvをウイルスベクターにより発現させ、すべてのクローンが最大の導入／発現効率を発揮した状況でウイルス増殖阻害効果を検証する。また、作用機序の異なるクローンを併用することにより、RV増殖阻害能力が相乗的に向上するかを確認する。

Causes of Carryover

当初の計画では新たにマウスへのRV接種試験を行い、プロテオーム解析を実施する予定であった。しかし、過去に実施したRV接種／非接種マウス脳のマイクロアレイ解析結果の再検証を行うとともに、他グループの論文報告のデータも複数検証したが、RV感染細胞・組織のみに発現している宿主遺伝子／蛋白質を確認できなかったことから、現時点で新たに動物実験およびプロテオーム解析を実施しても得られる成果は少ないと判断したため、実施しなかった。これにより、当初計画していたマイクロアレイスライド、マイクロアレイ用試薬類の購入を行わなかったことから、次年度使用額が生じた。この他に、2017年3月末までに、バキュロウイルスの作製のために試薬類等を購入したが、実際の会計手続きが4月以降に行われたため、次年度の使用額として計上されることとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に計画しているナノ粒子の合成およびウイルスベクター作製にかかる材料費、酵素類、シークエンス関連試薬等の購入費用として使用される。