2016 Fiscal Year Research-status Report

牛の子宮内膜炎に関するファージを用いた新規治療法の開発

Research Project

Project/Area Number	16K08055
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	安藤貴朗鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (40406898)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	樋口豪紀酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (00305905) 岩野英知酪農学園大学, 獣医学群, 教授 (60382488) 窪田力鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (80420652)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	牛 / 繁殖 / 子宮
Outline of Annual Research Achievements	牛の生産で優先されるのは、乳用牛では分娩後の泌乳量の確保と後継牛の生産、肉用牛では生涯で多数の産子を獲得して収益を上げることであり、牛の妊娠率を上昇させることは生産性の向上に不可欠である。分娩後の牛の子宮内に感染した細菌を早期に特定して治療を行うことにより、子宮内環境を改善することが妊娠率を向上させるために必要である。細菌感染症の治療としては抗生剤の使用が一般的であるが、薬剤耐性菌の出現により抗生剤を用いない新規の治療法が望まれている。ファージの抗菌作用を用いた感染性疾病に関する研究は、マウス、人、牛、馬などに対する臨床応用を視野に入れた研究が行われており、それらの技術を応用して子宮内膜炎の起因菌種に対しても有効なファージを利用した新規治療法を確立するために調査を行った。平成28年度は、分娩後の子宮内感染細菌の分離として、分娩2週後の黒毛和種繁殖牛15頭およびホルスタイン搾乳牛17頭について、子宮からの灌流液採取と細菌分離を行った。子宮灌流液は外陰部より子宮頸管を通過させたカテーテルにより、生理食塩水50mlを注入後にマッサージを行い、その後に回収を行うことで採取した。採取した灌流液は正常を記録後、培地に塗布して有意菌の分離を行った。また、灌流液の一部は遠心分離により上清と細胞成分に分け、上清はサイトカイン測定－30℃まで凍結保存した。細胞成分は細胞数と種類の割合を記録した。採取された細菌は菌種の同定後、ファージの溶菌性を確認するために―30℃で保存した。現在、採取した細菌に対するファージの溶菌性を調査中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成２８年度の研究では、分娩後の子宮内感染細菌の分離を、子宮からの灌流液採取と細菌分離について黒毛和種繁殖雌牛およびホルスタイン搾乳牛から実施する計画であった。これらについては、研究計画全体の半数の採取を実施できており、予定通りの採取状況となっている。現在は、子宮内感染細菌に対する特異的ファージの分離を実施しており、これらの結果を平成２９年度の研究計画に反映する予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後の研究実施予定としては、引き続き分娩後の子宮内感染細菌の分離とファージの選択を実施する。具体的には、黒毛和種繁殖牛およびホルスタイン搾乳牛より①子宮からの灌流液採取と細菌分離、② 子宮内感染細菌に対する特異的ファージの分離とカクテル化の2段階で調査を継続するとともに、細菌性子宮内膜炎に対するファージセラピーの応用として、臨床応用の可能性について黒毛和種繁殖牛を対象に、①子宮内膜炎に対するファージセラピーの実施と②治療後の繁殖成績の解析について調査を行う。細菌性子宮内膜炎に対するファージセラピーの応用について、子宮内膜炎に対するファージセラピーの実施については、子宮灌流液を採取した黒毛和種繁殖雌牛のうち細菌が分離されたものを供試牛として使用する予定である。子宮灌流液の採取1週後（分娩3週後）に、溶菌性を持つファージを子宮内に投与する群（ファージ群）と、生理食塩水を投与する群（対照群）に分け、ファージ投与の2週後（分娩5週後）に灌流液を採取し、灌流液からの細菌の分離、白血球サブセット解析、サイトカイン測定を実施するとともに、生殖器超音波検査を行い子宮および卵巣機能の評価を実施する。さらに、ファージ群および対照群について、治療後の繁殖成績（授精日数、授精回数、空胎期間、受胎率など）を比較して、治療効果を検証する。
Causes of Carryover	次年度使用額が生じた理由について、分娩後の子宮灌流液から採取した細菌について、病原性を有していると考えられる細菌の検出率が想定ほど多くなかったことが挙げられる。そのため、ファージを用いた治療を実施するための際菌種を特定できず、ファージの溶菌性を解明するための手技をすべての細菌に対して実施することができず、予算の一部を次年度での調査に用いることとなった。また、子宮灌流液データの採取について、追加での検体採取を検討することとなったため、ホルモン測定については経費の削減の観点から、次年度に測定を予定することとした。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度使用額については、子宮からの灌流液採取と細菌分離、を行い、それらの子宮内感染細菌に対する特異的ファージの分離に使用する予定である。また、子宮内からの細菌の分離の有無による血液および灌流液中のホルモン測定を実施するのに使用する予定である。