2016 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
16K08059
|
|---|
| Research Institution | Osaka Prefecture University |
|---|
Principal Investigator |
玉田 尋通 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (10155252)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲葉 俊夫 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (00137241)
川手 憲俊 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (80221901)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | ウシ / 卵子 / 成熟培養 / MAPK / 胚盤胞 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
MAPKは卵子・卵丘細胞複合体のギャップ結合（GAPJ）の崩壊を促進し、卵丘細胞から卵子への各種因子の輸送を抑制する。そこで、ウシ胚作製効率の改善に向けて、MAPKK阻害によりMAPKを抑制するU0126の成熟培養液への添加がGAPJ崩壊の遅延およびその後の胚発生に及ぼす影響を調べた。
交雑種および黒毛和種の卵巣を用い、直径2～6 mmの卵胞から卵子を吸引し、成熟培養の最初の2時間、5 μMあるいは10 μMのU0126を添加した（対照群には溶媒を添加）。その後、卵子を通常の成熟培養液に移して21～22時間成熟培養を継続し、続いて媒精と発生培養を行った。媒精日を0日として2日に分割率を、9日に胚盤胞の発生率と細胞数（栄養膜と内部細胞塊）を調べた。また、5 μM添加群と対照群について、成熟培養開始から0、4、18、24時間後に主なGAPJ構成因子であるコネキシン43を免疫蛍光染色し、卵子・放線冠細胞（OC）間のGAPJの崩壊を推定した。
結果は、分割率には群間で差はなかった。胚盤胞発生率は対照群 (15%) と比べて5 μM添加群 (28%) で有意に増加したが、10 μM添加群 (18%)では差がなかった。胚盤胞の細胞数は群間で差はなかった。GAPJの崩壊が推定された卵子の割合は0時間では両群とも0%であったが、4時間後では添加群は25%であり、対照群の44%より有意に低かった。18、24時間後では両群の値は75%以上であり、群間に差はなかった。
以上の結果から、ウシ卵子の成熟培養時に5 μMのU0126を2時間添加することにより、胚盤胞発生率が増加することを明らかにした。この処置はOC間のGAPJの崩壊を遅延するものと考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ウシ卵子の培養による胚作製実験では、夏季に胚発生率が低下し、実験が困難になる。また、大阪府では牛卵巣の入手が比較的困難であるが、羽曳野食肉衛生検査所の協力を得ることができ、毎週１回程度の頻度で１５頭以上の牛から卵巣を採取することができた。このため、胚作製実験については、７、８、９月の最も暑い期間を避けることができ、実験を順調に実施することができた。また、予備実験により、薬剤（U0126）の濃度設定をある程度予測できたため、実験を滞りなく実施できた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度には成熟培養時におけるウシ卵子の胚発生能マーカー遺伝子発現に及ぼすU0126添加の影響を調べるとともに、本研究によるU0126を添加する成熟培養法に我々が報告した胚培養法（Sakagami et al., J Reprod Dev, 2012, 58, 140-6; Sakagami et al., J Vet Med Sci, 2014, 76, 1403-5)すなわち、培養液にEGFとIGF-Iを添加し、さらに適量のグルコースを後期に添加する胚培養法を組み合わせ、高い確率で胚盤胞を作製できる総合培養系を確立する。また、平成30年度の実施を予定しているOPU法で得られた卵子を本研究の総合培養系で成熟・胚発育させることにより得られた胚盤胞をウシ子宮に移植して、得られた胚盤胞が正常に発育するか否かを調べる実験についても、できるだけ早くから開始・継続する。ウシの妊娠期間は約280日であり、結果が出るまでに長期間必要であり、早期に実験を開始しないと再検討が困難になるものと思われる。
これらの実験を通して、OPUにより優良牛から得られた卵子を効率よく胚盤胞にまで発育させ、この胚をレシピエントの子宮へ移植することにより、優良な遺伝子を持つ多くの新生子を産生することに貢献できる。
|
