2019 Fiscal Year Annual Research Report
Research on a possible novel transcriptional regulation by a membrane protein
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16K08066
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
山口 聡一郎 北海道大学, 獣医学研究院, 准教授 (50596864)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | TMC1 / タンパク質切断 / 転写調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに明らかにしたmTMC1の主要な細胞内N端領域の断片のみを発現するベクターを構築し、HEK293細胞に強制発現させた。この時、ベクターとしてEGFP(緑色蛍光タンパク質)も共に発現するpIRES2-EGFPベクターを用いた。よって、発現する細胞はEGFPの蛍光を発する。セルソーターでベクターがトランスフェクションされた細胞を分取し、mTMC1のN端を発現させた細胞と、空のベクターのみがトランスフェクションされた細胞を集めた。それぞれのmRNAを抽出し、次世代シーケンサーを用いてRNAseqを行ったところ、複数の遺伝子においてmTMC1の細胞内N端領域の発現により有意な変化が認められた。その中の最も大きな変化を示した三つの遺伝子については、リアルタイムPCRによる発現比較を行ったところ、同様に有意な変化が認められた。
一方で、有毛細胞の内因性のmTMC1の切断現象の有無を調べるため、蝸牛のwhole mount標本での免疫染色を試みたが、所有する三種類の抗mTMC1抗体のいずれもmTMC1特異的な染色は認められなかった。また、蝸牛のタンパク質を抽出し、western blotでのmTMC1断片の検出を試みたが、切断されていない全長のmTMC1も検出できなかった。よって、内因性のmTMC1が切断されるか否かはさらなる研究が必要である。
しかし本研究全体として、培養細胞での強制発現系ではあるが、TMC1の細胞内N端領域が切断され、核移行シグナルを介して核に集積することがあることを示すことができた。さらに、切断されたmTMC1の細胞内N端領域が何らかの機序で転写調節を行う可能性も示唆することができた。これらはmTMC1の新しい機能の可能性を提示する成果となる。
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