2016 Fiscal Year Research-status Report
中枢性浸透圧感知における新規TRPV1分子の機能解析
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16K08073
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
澁谷 泉 鳥取大学, 農学部, 教授 (50162649)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
保坂 善真 鳥取大学, 農学部, 教授 (00337023)
北村 直樹 鳥取大学, 農学部, 准教授 (80301951)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 視索上核 / バゾプレシン / TRPV1 / TRPV1_SON |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TPRV1ならびに、本研究室で新たに発見したそのスプライスバリアントであるTRPV1の機能をHEK293細胞にそれぞれの分子を単独で発現、あるいは共発現させてパッチクランプ法および細胞内Ca2+濃度画像解析法にて解析した。共発現ベクターは２種の分子をGly20で構成されるリンカーで結合する構造を採用した。その結果、TRPV1発現細胞においてのみTRPV1アゴニストであるカプサイシンに応答がみれれた。さらにTRPV1発現細胞においては、マニトール50mMによる浸透圧増加刺激に対しても応答が観察された。しかし、TRPV1_SON発現細胞およびTRPV1とTRPV1_SONの共発現細胞では、カプサイシンに対しても浸透圧増加に対しても反応は観察されなかった。リンカーの妥当性と確認するために、TRPV1を同様のリンカーで結合したベクターも作成し、HEK293細胞に発現させてTRPV1単独発現細胞とカプサイシン応答性、浸透圧応答性を被核して差がないことを確認した。これらの結果は、TRPV1が浸透圧感知分子であること、およびTRPV1_SONはおそらくはDominant negative分子としてTRPV1の機能を抑制することを示唆している。一方、TPRV1単独発現細胞でのカプサイシン誘発電融と浸透圧増加によって誘発される電流の逆転電位はほぼ０mVで一致していたが、視索上核ニューロンにおいて観察されたカプサイシンあるいは浸透圧増加誘発電流の逆転電位（約-40 mV）とは大きく異なっており、中枢性浸透圧感知分子の分子実体がTRPV1単独でホモテトラマーを形成する分子では無いことも示唆している。
加えて、TRPV1とTRPV1_SONのmRNAのラット脳における分布をin situ hybridization法を用いて解析する手法を確立し、浸透圧感知機能を有する中枢部位である視索上核（SON）と脳弓下器官（SFO）において両者のシグナルを得た。さらにSONでは腹側のバゾプレシンニューロン領域にシグナルが集結していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
中枢性浸透圧感知分子の分子実体解明のため、TRPV1とTRPV1_SONを単独あるいは共発現するベクターの作成に成功し、その機能を解析することができた。TRPV1分子には浸透圧増加に対して陽イオン電流を生じ、細胞内Ca2+濃度を増加させる機能があることが証明できた。一方、TRPV1_SONに関しては、単独では機能がなく、TRPV1と共発現するとその機能を抑制する可能性があることを解明できた。これらは中枢性浸透圧感知分子の実体解明について重要な手がかりを与えている。
さらに、TRPV1ならびにTRPV1_SON分子の脳内分布を解析する手法が確立できたことは次年度以降の研究への重要なステップとなったと考えている。
機能的ならびに形態的な解析が軌道にのった、という点において当初の計画通りの進行状況であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
TRPV1とTRPV1_SONのラットの脳での分布ならびに、それら分子を発現する細胞の特定をin situ hybridization法ならびに免疫組織化学の手法で行う。
これら分子を発現する細胞が特的できたら、その細胞におけるTRPV1の役割について、パッチクランプ法ならびにCa2+画像解析法にて機能的な解析を行う。
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| Causes of Carryover |
実験計画で予定していた実験動物の必要数が少なく済んだため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2017年度の物品経費として使用する。
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