スンクスは新しい糖代謝解析モデル動物となるか？ －肉食性糖尿病モデルへの可能性－

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08088
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 佐々木 典康 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (20307979)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 金田 剛治 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 准教授 (10350175)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2019-03-31
• Keywords: スンクス / 糖代謝 / レプチン / 糖尿病 / 肝臓 / 脂肪組織

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、肉食性の強い実験小動物であるスンクス(Suncus murinus)を、新たな糖代謝解析モデル動物として利用するために、スンクスの糖代謝特性、特に肝臓での糖代謝特性を明らかにすることである。完全肉食動物は常に糖新生活性が高く、その正常糖代謝はヒトの糖尿病における糖代謝状態に類似していること、および早期糖尿病発症スンクスの糖代謝異常を明らかにすることで、全く新しい糖尿病の病態解析モデル動物となることが期待されるので、この可能性を検討する。
平成28年度は脂肪細胞から分泌されるアディポカインであるレプチンの遺伝子をクローニングし、そのコード領域を決定するとともに一次構造の解析を行った。スンクスは皮下脂肪こそ持っているが、内臓脂肪をほとんど有しておらず、糖代謝におけるレプチンや内臓脂肪の役割解明が期待される。
今回、BK系統のスンクスを用いて皮下脂肪細胞に発現しているレプチン遺伝子のクローニング行ったところ、513塩基対のコード領域が認められ170アミノ酸残基からなるスンクスレプチン前駆体の配列を得た。推定シグナルペプチドを解析したところ、アミノ末端側21残基がシグナルペプチドと予想され、切断後の149アミノ酸が成熟レプチンとして血中に分泌されると予想された。他の動物種のレプチン配列と比較したところ、ネコ、ウシ、イヌのレプチン配列とは80％程度の相同性を有しているものの、C末端側の領域に3～4アミノ酸残基の欠損が認められた。今後はこの欠損がレプチンの機能ならびに糖代謝に及ぼす影響を検討していく予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究は平成28年度に追加採択を受けたプロジェクトであるため、研究の開始時期が遅れ、当初予定したスケジュールでの進行が困難であった。そのため、研究の遂行順序を一部入れ替え、当初、平成29年度に中心的に行う予定であったレプチン遺伝子のクローニングを先に実施することにした。スンクスレプチンの同定に関しては順調に進んでおり、さらに組換え体の発現系を現在構築中である。平成29年度中に、このスンクス組換えレプチンを用いて、血中濃度の測定ならびに機能解析を行う予定である。一方で、当初から計画していた肝臓における糖代謝関連酵素のin silico解析については、グルコキナーゼおよびグルコキナーゼ調節タンパク質の検索を実施済みであり、順調にデータが得られている。今後は遺伝子およびタンパクレベルでの解析を行う予定としている。平成28年度に実施予定であったスンクス初代培養肝細胞系については平成29年度に取り組む予定としている。全般としてはデータが得られている研究部分も多いが、当初計画から総合的に判断した場合には、やや遅れていると判断せざるを得ない状況である。

Strategy for Future Research Activity

現在構築中のブレビバチルス発現系を用いたスンクス組換えレプチンの発現と精製を行い、安定して組換えレプチンを確保することを目指す。この組換えレプチンを用いることで、まずはスンクスの血中レプチン濃度の測定を目指す。基本的にはウェスタンブロット法を利用して濃度測定するが、スンクスレプチンにも反応する抗体が入手できればELISA測定系の構築も試みる。
さらにスンクス初代培養肝細胞系の作成を行い、肝細胞での糖取り込み能の検討およびレプチン添加による影響の有無などを観察する予定である。初代培養系は細胞の安定供給が難しいことを踏まえ、皮下脂肪を利用した脂肪細胞由来幹細胞の採取および、肝細胞への分化についても併せて検討を行い、培養細胞を用いた代謝評価系の確立を目指す。
現在、系統を維持しているBK系および早期糖尿病発症スンクスのEDS系を今後も安定して維持し、両者の肝臓における遺伝子発現の差異を比較検討する。また先に構築したレプチン測定系を用いてEDSにおける血中レプチン濃度の変化を検討する予定である。ただし、この検討については平成30年度の実施になることが予想される。

Causes of Carryover

本申請は追加採択であったためプロジェクトの開始が下半期からとなり、全体として進行がやや遅れている現状にある。そのために一部の実験については着手時期を変更しており、当初、平成28年度に開始する予定の実験を一部平成29年度の開始とし、逆に進展が早いと予想されるレプチン遺伝子のクローニング実験を前倒しして平成28年度に開始するなどの対策を行った。これらの変更に伴い平成28年度使用分の予算が若干ではあるが圧縮されたため、一部予算を平成29年度へ移行し次年度使用額が生じたものである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

当初、平成28年度に購入を予定していたタンパク質実験（ウェスタンブロット）用の抗体を平成29年度に購入する。平成28年度予算から移行させた残額とあわせ、必要な抗体の購入費に充てる予定である。概ね現在の支払額で賄えると推定しているが、全体の進行がやや遅れていることも考慮し、平成29年度の計画の一部（スンクス個体を使ったin vivo実験）は平成30年度の実施に変更することも検討している。