タイムラプスイメージングに基づく膵島形成原理の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08090
• Research Institution: Kansai Medical University
• Principal Investigator: 吉田 真子 関西医科大学, 医学部, 講師 (40392170)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 膵臓発生 / 膵島形成 / 多色細胞系譜追跡実験 / ノックインマウス / Sox9

Outline of Annual Research Achievements

糖尿病の主な原因としてインスリン産生β細胞の細胞数減少および機能低下が知られており、その根本的な治療法として膵島移植に一定の成果が認められている。近年、ドナー不足の問題を解消できるiPS細胞を利用した移植再生医療への期待が高まっており、β細胞を効率的に誘導するための研究開発が盛んに行われている。しかしながら、安全性評価およびコストなどの観点から、スタンダードな治療法として確立されるまで、引き続き多くの時間を要するものと考える。 そこで、本研究では発生生物学的アプローチにより膵島形成原理を解明し、再生医療分野への貢献を目指すこととした。具体的には、原始膵管に出現する膵前駆細胞が、どのような仕組みで離層・移動・集合・分化・増殖して機能的膵島が構築されるのか、タイムラプスイメージング法を用いた単一細胞レベルでの詳細な動態解析を行い、 その分子機構解明を試みた。
本研究課題を遂行するため、Sox9-IRES-CreERT; Rosa26-Rainbowマウスを用いて多色細胞系譜追跡実験を実施した。本マウスでは、タモキシフェン誘導によってSox9陽性膵前駆細胞が青・橙・赤の3色いずれかに標識され、その後の細胞の遷移様式を詳細に追跡することが可能である。具体的には、胎生12.5日目のSox9-IRES-CreERT; Rosa26-Rainbowマウスの膵臓原基を摘出し、発生期膵臓のex vivo培養を実施した。培養2日後に培地中にタモキシフェンを添加することにより、Sox9陽性膵前駆細胞を特異的に標識し、その翌日から共焦点蛍光タイムラプスイメージング法を用いた解析を行った。その結果、原始膵管に出現したSox9陽性細胞から膵管・腺房・初期膵島への発生が認められた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、ノックインマウスを交配して得られるSox9-IRES-CreERT; Rosa26-Rainbowマウス胎仔を主な実験材料として用いており、原則としてプラグ確認を行った妊娠マウスが必要である。この妊娠マウスの作製並びにgenotyping陽性のマウス胎仔（即ち研究対象となる実験サンプル）を安定的に取得することが困難な場合があった。その他、共焦点蛍光タイムラプスイメージング法を実施するにあたり、撮影条件の検討を繰り返す必要があり、現在のところ、データ取得のための最適な条件決定には至っていない。このような理由から、研究の進展がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

膵臓の発生過程において原始膵管からどのようにして膵前駆細胞が離層・移動・集合・分化・増殖して膵島が構築されるのか明らかとするため、引き続きタイムラプス イメージング法を用いた単一細胞レベルでの詳細な動態解析を行う。本目的を達成するため、既存のRosa26-Rainbowマウスに加え、研究代表者が所属する研究室にて新たに開発が進められているより多色での蛍光標識が可能なRosa26-double Rainbowマウスを利用することを検討中である。その他、Sox9-IRES-CreERT; Rosa26-Rainbowマウス胎仔由来膵臓原基のex vivo培養によって発生した初期膵島に対し、膵島を構成する各種内分泌細胞に特異的な抗体を用いて蛍光免疫染色を実施し、膵島細胞の発生起源について解析を試みる。