2016 Fiscal Year Research-status Report
海洋性硫黄酸化細菌の機能解析とバイオリーチングへの利用
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16K08112
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
上村 一雄 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (80294445)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 硫黄酸化細菌 / 海洋性細菌 / チオ硫酸デヒドロゲナーゼ / 硫黄代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．A. thiooxidans SH株の硫黄代謝系の遺伝子レベルでの解析： ショットガンライブラリと8kb paired-endライブラリを用いて、次世代シーケンサーにより 海洋性硫黄酸化細菌 A. thiooxidans SH株ゲノムの全塩基配列を決定した。その塩基配列を用いて元素硫黄、チオ硫酸、テトラチオン酸、硫化水素、亜硫酸の酸化酵素遺伝子と、末端酸化酵素をコードすると考えられる遺伝子を相同性解析によって明らかにし、硫黄化合物代謝系を推定した。SH株は、他のthiooxidans株と類似した硫黄代謝関連遺伝子を保持していた。
２．チオ硫酸デヒドロゲナーゼ（Tsd）遺伝子の決定と解析： チオ硫酸生育細胞から精製したチオ硫酸デヒドロゲナーゼは、キノンを電子受容体に用いる膜酵素であった。精製酵素のトリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列を用いて、SH株の全ゲノムからTsd遺伝子を決定した。この遺伝子は、他のA. thiooxidansには存在しておらず、その遺伝子構造から、SH株は、この遺伝子を水平伝播によって獲得したものと推定された。相同性解析や既知のA. thiooxidansゲノムとの比較によって、その起源等を推定した。
３．チオ硫酸代謝の末端酸化酵素の解析：チオ硫酸代謝にはキノン電子輸送体に使用する代謝系を用いるものと推測された。SH株のゲノムには、４種類のbd型ユビキノール酸化酵素と２種類のbo型ユビキノール酸化酵素の遺伝子が存在していた。チオ硫酸の酸化に使用される末端酸化酵素を決定するため、ヘムを持つオキシダーゼの人工基質であるTMPDを電子供与体に用いて、チオ硫酸生育細胞から末端酸化酵素を精製し、その遺伝子の同定を試みた。その結果、bo型の酵素が検出され、ユビキノール酸化酵素活性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究項目は、（１）SH株の硫黄代謝系の遺伝子レベルでの解析、（2）チオ硫酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の決定と解析、および（末端酸化酵素の解析遺伝子の決定である。
（１）については、SH株の全ゲノム配列の決定により、硫黄代謝系に関与する遺伝子の同定と代謝系の解析を行うことができた。SH株は、16S rRNA遺伝子の相同性解析によって、A. thiooxidansと同定されたが、全ゲノムの解析によって、SH株はthiooxidansとの相同性が低いことが明らかとなった。これは予期しなかった結果で、新規な種である可能性が示唆された。（2）については、ゲノムの塩基配列が明らかになったことで、チオ硫酸デヒドロゲナーゼの遺伝子が決定できた。遺伝子は、膜タンパク質であるポーリンと相同性が高く、他のSH株には存在しないことが明らかとなり、この結果も予期しないものであった。（3）については、部分精製した末端酸化酵素複合体にチオ硫酸デヒドロゲナーゼのタンパク質が検出され、複合体はユビキノール酸化酵素活性を示した。タンパク質のアミノ酸配列の情報から、ユビキノール酸化酵素活性を示すタンパク質の遺伝子を決定した。酵素複合体のタンパク質は、bo型ユビキノール酸化酵素をコードすると推定される遺伝子にコードされていた。
これらの成果は、当初の計画の順調な遂行によって得られたが、予期しなかった成果も含まれており、当初の計画以上に進展していると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究は、計画通り順調に進行しており、得られた成果に基づいて、チオ硫酸酸化酵素遺伝子の大腸菌内での発現と組換えタンパク質の機能解析を推進する。末端酸化酵素については、部分精製した酵素複合体の解析を再度実施し、再現性を確認しつつ、末端酸化酵素の性質とその遺伝子を最終的に決定したい。
本研究は、チオ硫酸デヒドロゲナーゼの解析を中心に、硫黄代謝系の解析を行うこととしているが、末端酸化酵素の精製の過程で、シトクロームｃを多く含む画分が得られたので、シトクロームｃの解析と硫黄代謝にシトクロームｃがどのように関与しているかについても、新たな課題として取り組みたい。
最終的には、ゲノム解析と生化学的解析により、チオ硫酸以外の硫黄化合物も含めた硫黄代謝系の全容解明も試みたい。
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Research Products
(6 results)
