2018 Fiscal Year Annual Research Report
Study on cold-adapted carbohydrate hydrolases according to the construction of simultaneous saccharification and fermentation process
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16K08116
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
上田 光宏 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (50254438)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
玉田 太郎 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 上席研究員(定常) (50391248)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 低温適応性酵素 / 糖質分解酵素 / マンナン分解酵素 / 塩橋 / X線結晶構造解析 / 生デンプン分解酵素 / バイオ燃料 / 連続糖化発酵法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度も低温糖化・低温発酵システム構築に向けてミミズ由来の低温適応性新規糖質分解酵素に関する研究を引き続き行った．（１）ミミズ由来のマンナン分解酵素の低温活性を向上させるために，塩橋に着目し構造と機能の解析を行った．これまでに，ミミズ由来のマンナン分解酵素（Ef-Man)は好冷性酵素である南極トビムシ（Cryptopygus antarcticus）由来マンナナーゼ（Ca-Man）と構造が似ていることを明らかにしている．しかしながら，Ef-Man（最適温度60℃）はCa-Man（最適温度35℃）に比べ低温活性が低く，この違いは構造のわずかな違いに起因していると考え，タンパク質の構造の安定化に寄与している塩橋に着目した．これまでに塩橋を消失させることで低温活性が向上するという報告は存在するが、塩橋を弱めた際の影響についての報告はほとんど存在しない。そこで、Ef-Manに存在する塩橋を弱めることによる低温活性を向上させるための研究を行った．R125、R213、R302の三つのアミノ酸残基に注目し、部位特異的変異導入法を用いて塩橋を弱めた３種類の変異酵素を作製した。野生型（WT）と変異酵素3種の低温活性を比較したところ、R302KがWTよりも高活性を有することが明らかとなった。以上の結果より、塩橋を弱めるという方法は熱安定性を維持しながら低温活性を向上させることが明らかとなった。さらに，他の微生物由来のマンナナーゼと低温活性（30℃）の比較を行ったところ，ミミズ由来の変異酵素の方が2~4倍比活性の高いことが明らかとなった．本酵素は低温下で利用する上で優位性を有ることを明らかにした．
（２）ミミズ由来の低温適応性生デンプン分解酵素の構造と機能の解析に関する研究を行った．ミミズには2種類の生デンプン分解酵素(AmyIとAmyII )が存在している．すでにAmyIに関してはX線結晶構造解析より高次構造を明らかにしているので，AmyIIの高次構造を明らかにした．
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