2017 Fiscal Year Research-status Report

細胞生物学的視点からの脱皮機構解析：脱皮阻害剤の作用機序解明とその応用

Research Project

Project/Area Number	16K08142
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	林謙一郎大阪大学, 医学系研究科, 准教授 (90238105)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中川好秋京都大学, 農学研究科, 准教授 (80155689)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	benzoyl phenylurea / ガン関連線維芽細胞 (CAF) / 細胞運動 / がン逡巡 / 0-NBD / ATIC / 昆虫表皮真皮細胞
Outline of Annual Research Achievements	昨年度に引き続きニカメイガ表皮真皮細胞の初代培養系の確立に向けた培養条件の検討を行った。培地にニカメイガ杯抽出液（卵抽出液）を添加した培養系及び新たなコーティング素材としてキトサンを用いた培養系を検討した。いずれの場合も表皮真皮細胞の増殖は認められず、表皮真皮細胞培養系の確には至らなかった。一方、研究実施計画に記した第二の研究目的であるBPUによるガン細胞転移・浸潤の抑制効果の検証とその分子機構の解明研究においては著明な進展があった。昨年度の研究で、BPU類縁体No.4 (BPU4) 及びNo.17(BPU17)は著明なガン関連線維芽細胞(CAF)の細胞運動阻害効果（創傷治癒アッセイ）及びマトリゲルへの浸潤抑制効果を発揮し、さらに扁平上皮ガン細胞(SCC)がCAFを介して集塊を形成して移動するcollective cell invasionを抑制することを見いだした。このBPUの作用機序解明のためBPU17の標的タンパク質の検索をO-NBD ユニットを導入したBPU17 類縁体を合成して行った。この方法はO-NBDを導入した低分子リガンドと標的タンパク質が結合すると標的タンパク質のリガンド結合部位近隣のリジン残基のアミノ基とO-NBDユニットが反応して蛍光性のN-NBDユニットが標的タンパク質に付加されるという原理を応用したものである。この結果、70 kDaのタンパク質が蛍光標識され、生化学的手法で部分精製した後、マススペクトルによる解析に供したところ、Bifunctional purine biosynthesis protein PURH (ATIC) の408番目のリジン残基に蛍光ユニットN-NBDが付加していることが明らかになり、ATICがBPU17の標的タンパク質である可能性が示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究の第一目的である以下の仮説（昆虫の脱皮過程初期に、表皮真皮細胞は扁平状から円柱状に変化する。この過程でEMT的変化が起こり、細胞運動が亢進するが、脱皮阻害剤BPUはこの変化を阻害し、脱皮を妨げる）の検証に必要なニカメイガ表皮真皮細胞培養系の確立を目指して研究を引き続き行ったが、この培養系の確立に難航している。培養条件の検討やニカメイガ杯抽出液（卵抽出液）の添加を試したが、うまくいっていない。一方、第二の研究目的であるBPUによるガン細胞転移・浸潤の抑制効果の検証とその分子機構の解明研究は順調に進展している。研究実績の概要で記載したように、この研究に関しては期待以上の成果を得ることができた。このため「おおむね順調に進展している」と評価した。
Strategy for Future Research Activity	１）BPUによる筋線維芽細胞機能阻害機構の解明に向けた研究：　平成２９年度の研究でATICがBPU17の標的タンパク質である可能性が示唆された。今年度はATICの機能解析を予定している。先ず、siRNAを介したノックダウンがCAFの運動能やマトリゲルへの浸潤能に及ぼす効果を検証する。さらに、これまでに得られた知見からBPUが繊維化疾患の発症要因である上皮間葉転換(EMT)を阻害し、繊維化疾患の進展を抑制する可能性が期待される。この可能性を検証する。これに関しては網膜症の要因とされる網膜色素上皮細胞のEMTに及ぼすBPUの影響を培養系と動物実験による解析を計画している。２）In vivoでのBPUの評価検証：皮下組織において原発巣からの離脱・周辺組織への浸潤・血管内侵入能があるメラノーマBL6細胞を用いてBPUのin vivoでのガン細胞転移抑制効果を検証する。BL6細胞をマウスの足蹠に接種後、コントロール群とBPU投与群に分け一定期間内に肺転移したガン細胞のコロニー数を測定し転移抑制効果の評価を行う。また、繊維化疾患の進展に対する効果を評価する動物実験も計画している。３）ニカメイガ表皮真皮細胞培養系の確立を目指した研究：昨年度に引き続き培養条件の検討を行う。培地にニカメイガ幼虫抽出液を分画し、培地に添加した培養系等を考えている。また、剥離した表皮組織からの真皮細胞の分散方法についても改変を行い、最適条件の検討を行う。
Causes of Carryover	In vivoでの解析と論文投稿・発表を予定しているため、前年度の研究はできるだけ費用を節約して施行した。このため次年度使用額（B-A）欄が「0」より大きくなった。今年度の研究計画では動物を用いた解析やEMTに関連する解析を予定している。動物実験施設の使用料や実験動物購入及び論文発表に多くの費用がかかると考えている。繰り越した金額はこれらに当てる予定である