2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒトゲノム由来の染色体外因子・・その基礎的理解から、革新的細胞工学技術へ
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16K08144
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
清水 典明 広島大学, 生物圏科学研究科, 教授 (10216096)
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2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 染色体外因子 / 遺伝子増幅 / Double Minutes / 細胞工学 / 染色体工学 / 組み換え蛋白質生産 / エピソーム / gene silencing |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（A）ヒトゲノム由来の染色体外因子であるDMの動態に関する基礎的理解が深まった。すなわち、ヒト・げっ歯類の細胞融合によりヒト染色体が選択的に断片化し、DMが効率よく形成されて安定に維持されることを見出し、その理解を深めた。そのようなDMの形成と維持は、低酸素で効率が良いことが示唆された。また、独自な遺伝子増幅系であるIR/MAR遺伝子増幅法でDMが形成される効率は、低酸素状態で効率良くなることを見出したが、低酸素により誘導されるSirt1をCas9により欠失させても大きな影響を受けることを見出した。さらに、DMの排出に関わると考えられる細胞質bLebの効率が Sirt1の機能と関連することを見出した。このような発見は、遺伝子増幅と細胞質運動が関連することを示唆しており重大である。（B）DMを介する遺伝子増幅系を応用する研究に大きな進展が見られた。すなわち、IR/MAR遺伝子増幅法と人工染色体技術を融合させるために、IR/MAR、目的遺伝子、人工染色体との相同配列の3者を持つプラスミドを、相同配列を切断するCRISPR/Cas9プラスミドと同時導入すると、極めて効率よく人工染色体上で増幅することを見出し、その機構を示唆する結果を得た。この方法を用いて、人工染色体上でLacO配列を増幅させ、それをLacR-GFPで可視化することに成功した。この方法は、標的とする任意の染色体領域で、目的遺伝子を増幅する方法として発展させることが可能であり、大変重要であるため、現在そのような研究を集中的に進めている。さらに、増幅して反復配列となると遺伝子発現を抑制する配列と促進する配列の2種類があることを見出した。さらに、それを分類・理解を深めつつあるため、今後、任意の染色体領域で目的遺伝子を高い発現状態で増幅させるという独創的で重大な細胞工学領域の創成につながると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
研究代表者の独自技術であり多数の特許を取得しているIR/MAR遺伝子増幅法と、鳥取大の押村教授らが樹立した人工染色体技術を融合することは、当初からの大きな夢であったが、その方法については模索が続いていた。しかし、本研究を進める過程で、相同配列とCRISPR/Cas9を利用することが突破口になることを見出した。さらに、その機構を解明する過程で、この方法が、任意の標的とする染色体領域で目的遺伝子を増幅させる技術になることが強く示唆された。一方、遺伝子増幅して反復すると、発現を高める配列が存在することを見出し、独自に単離した２種類の配列を反復させることが極めて有効に発現を高める方法となることを見出した。このような２つの方向からの技術を融合すれば、独自性の高い革新的で重要な細胞工学技術を創生できることが示唆された。これは、当初計画では思いもよらなかった大きな進展である。さらに、基礎研究面でも、染色体外因子の形成・安定性と、それを介する遺伝子増幅にSirt1が関与すること、および、それが細胞質運動を介すること、が示唆されたが、これも当初計画が予想を遥かに超えて大きく進展した成果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
IR/MAR遺伝子増幅法と人工染色体技術を発展的に融合する研究は、上記のように現在までに大きな進展を得ることができたので、今後、それをさらに発展させる。具体的には、人工染色体上で、「目的遺伝子」と「発現を高める配列」（G５配列、B-3-31配列、その他）のみを同時に増幅させる技術を樹立する。人工染色体は細胞分裂に伴って極めて安定に分配され、しかも独自で人工的な環境を作ることが出来るため、安定で発現の高い状態で目的遺伝子が増幅出来る技術の樹立を目指す。一方、反復すると発現を高める配列と逆に抑制する配列を系統的に探索して、分類し、理解することを並行して行い、それを上記研究に応用できるようにする。さらに、この技術を、標的とする任意の染色体領域で目的の配列を増幅させる、という革新的細胞工学技術として発展させる。一方基礎面では、Sirt1遺伝子機能が、染色体外因子の安定性や細胞運動を介してどのように遺伝子増幅に影響するかを、さらに明確に理解する。
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| Causes of Carryover |
次年度は最終年度であり、研究をまとめるために大規模な実験を行う必要があり、そのため多量の消耗品を必要とするため。
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